{"id":12867,"date":"2021-01-31T13:19:55","date_gmt":"2021-01-31T18:19:55","guid":{"rendered":"https:\/\/nebula.org\/blog\/sequenciamento-de-dna\/"},"modified":"2021-02-20T20:22:25","modified_gmt":"2021-02-21T01:22:25","slug":"sequenciamento-de-dna","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/nebula.org\/blog\/pt-br\/sequenciamento-de-dna\/","title":{"rendered":"Sequenciamento de DNA &#8211; tecnologias para ler o c\u00f3digo da vida"},"content":{"rendered":"\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-what-is-dna-sequencing\">O que \u00e9 sequenciamento de DNA?<\/h2>\n\n<p>O sequenciamento de DNA \u00e9 um m\u00e9todo para determinar a ordem dos nucleot\u00eddeos em um<a href=\"https:\/\/nebula.org\/blog\/pt-br\/acido-dna-desoxirribonucleico\/\"> DNA<\/a> mol\u00e9cula. O sequenciamento de DNA revolucionou a gen\u00f4mica. Desde 1995, o sequenciamento de DNA tornou poss\u00edvel analisar os genomas de mais de 50.000 (em 2020) organismos diferentes. <\/p>\n\n<p>Juntamente com outros m\u00e9todos anal\u00edticos de DNA, essa t\u00e9cnica tamb\u00e9m \u00e9 usada para investigar doen\u00e7as gen\u00e9ticas, entre outras coisas. Al\u00e9m disso, no contexto da clonagem molecular, o sequenciamento de DNA tornou-se indispens\u00e1vel nos laborat\u00f3rios de biologia molecular e engenharia gen\u00e9tica.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-table\"><table class=\"has-subtle-pale-pink-background-color has-background\"><tbody><tr><td><a href=\"https:\/\/nebula.org\/whole-genome-sequencing\/\"><strong>Voc\u00ea est\u00e1 interessado em decodificar 100% do seu DNA? A Nebula Genomics oferece o sequenciamento completo do genoma mais acess\u00edvel! 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Hoje em dia, at\u00e9 mesmo o sequenciamento em larga escala de genomas inteiros se tornou comparativamente r\u00e1pido e f\u00e1cil. <\/p>\n\n<p>No entanto, os desafios do sequenciamento do genoma n\u00e3o se limitam apenas \u00e0 leitura direta da sequ\u00eancia de \u00e1cido nucleico. Devido a limita\u00e7\u00f5es t\u00e9cnicas, apenas se\u00e7\u00f5es curtas de DNA (leituras) de at\u00e9 1000 pares de bases s\u00e3o lidas em cada rea\u00e7\u00e3o de sequenciamento individual. Para uma longa fita de DNA, um m\u00e9todo conhecido como primer walking foi usado pela primeira vez em 1979. Nesse procedimento, a sequ\u00eancia foi lida pe\u00e7a por pe\u00e7a.<\/p>\n\n<p>Em um projeto de sequenciamento maior, o<a href=\"https:\/\/www.genome.gov\/human-genome-project\"> Projeto Genoma Humano<\/a> , v\u00e1rios bilh\u00f5es de pares de bases foram sequenciados. Isso foi feito por uma abordagem conhecida como sequenciamento de espingarda. Hoje, somos capazes de estudar doen\u00e7as, alvos de drogas, identifica\u00e7\u00f5es baseadas em DNA, etc. Gra\u00e7as \u00e0 tecnologia de sequenciamento de DNA maci\u00e7amente paralelo.<\/p>\n\n<p>No sequenciamento shotgun, a fita de DNA \u00e9 primeiro quebrada em fragmentos menores de nucleot\u00eddeos, que s\u00e3o ent\u00e3o sequenciados base por base. A informa\u00e7\u00e3o da sequ\u00eancia dos segmentos curtos individuais \u00e9 ent\u00e3o remontada em um genoma completo usando ferramentas de bioinform\u00e1tica.<\/p>\n\n<p>A seq\u00fc\u00eancia de dados brutos \u00e9 analisada a fim de obter informa\u00e7\u00f5es biologicamente relevantes. Sem ele, qualquer informa\u00e7\u00e3o de sequ\u00eancia permanece sem valor cient\u00edfico.<\/p>\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-sequencing-methods\"><strong>M\u00e9todos de sequencia\u00e7\u00e3o<\/strong><\/h2>\n\n<p>V\u00e1rios m\u00e9todos est\u00e3o dispon\u00edveis hoje para ler as informa\u00e7\u00f5es da sequ\u00eancia de DNA usando m\u00e1quinas de sequenciamento. Por muito tempo, os desenvolvimentos dos m\u00e9todos de sequenciamento foram baseados no sequenciamento Sanger. Os m\u00e9todos modernos oferecem possibilidades de sequenciamento acelerado por meio de sequenciamento altamente paralelo. Os novos m\u00e9todos de sequenciamento s\u00e3o freq\u00fcentemente chamados de sequenciamento de \u00faltima gera\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-classical-methods\"><strong>M\u00e9todos cl\u00e1ssicos<\/strong><\/h3>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-method-of-maxam-and-gilbert\"><strong>M\u00e9todo de Maxam e Gilbert<\/strong><\/h4>\n\n<p>O m\u00e9todo foi desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert em 1977. \u00c9 baseado em duas abordagens. A clivagem qu\u00edmica de base espec\u00edfica de DNA e subsequente separa\u00e7\u00e3o dos fragmentos por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. <\/p>\n\n<p>O DNA \u00e9 primeiro marcado em uma extremidade 5 &#8216;ou 3&#8217; com fosfato radioativo ou uma subst\u00e2ncia n\u00e3o radioativa (biotina, fluoresce\u00edna). Em quatro prepara\u00e7\u00f5es separadas, as bases espec\u00edficas da estrutura a\u00e7\u00facar-fosfato do DNA s\u00e3o ent\u00e3o parcialmente (limitadas) modificadas e clivadas. Por exemplo, a guanina b\u00e1sica (G) \u00e9 metilada pelo reagente sulfato de dimetila e removida por tratamento alcalino com piperidina.<\/p>\n\n<p>A fita de DNA \u00e9 ent\u00e3o completamente clivada. Em cada prepara\u00e7\u00e3o, s\u00e3o formados fragmentos de comprimentos diferentes, a extremidade 3 &#8216;dos quais sempre foi clivada em certas bases. A eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante separa os fragmentos de acordo com o comprimento, sendo as diferen\u00e7as de comprimento resolvidas por uma base. Comparando as quatro abordagens no gel, a sequ\u00eancia do DNA pode ser lida. <\/p>\n\n<p>Este m\u00e9todo permitiu que seus inventores determinassem a sequ\u00eancia do operon de um genoma bacteriano. Hoje, o m\u00e9todo raramente \u00e9 usado porque requer reagentes t\u00f3xicos. Al\u00e9m disso, \u00e9 mais dif\u00edcil de automatizar do que o m\u00e9todo didesoxi de Sanger desenvolvido ao mesmo tempo.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh4.googleusercontent.com\/uCg6Zgm2uOGHpyiUDS7Igrzb7G31oM5J0SUj4ogs32EHCEZK0jzoR1bxDYGf8cWtBwTjD25wqKCx3nIWN-gGmCkn66FZweUaOL4pJM9tYA08z9h3NArwrpZ-aqK66bZ11LY5k6Sm\" alt=\"Abordagem de sequenciamento Maxam Gilbert.\" title=\"Sequenciamento Maxam Gilbert \"\/><figcaption>Abordagem de sequenciamento Maxam Gilbert. Fonte da imagem: JHCaufield, Wikimedia Commons<br\/><\/figcaption><\/figure>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-dideoxy-method-sanger-sequencing\"><strong>M\u00e9todo didesoxi (Sanger<\/strong><strong> sequenciamento<\/strong> )<\/h4>\n\n<p>O m\u00e9todo didesoxi de Sanger tamb\u00e9m \u00e9 chamado de s\u00edntese de termina\u00e7\u00e3o de cadeia. \u00c9 um m\u00e9todo enzim\u00e1tico. Foi desenvolvido por Sanger e Coulson por volta de 1975. Foi apresentado em 1977 com a primeira sequ\u00eancia completa de um genoma (Bacteri\u00f3fago \u03c6X174).<\/p>\n\n<p>Sanger recebeu o Pr\u00eamio Nobel de Qu\u00edmica em 1980 por seu trabalho com sequenciamento de DNA. Ele recebeu o pr\u00eamio junto com Walter Gilbert e Paul Berg.<\/p>\n\n<p>A enzima<a href=\"https:\/\/nebula.org\/blog\/pt-br\/dna-polimerase\/\"> DNA polimerase<\/a> \u00e9 usado para alongar uma das duas fitas complementares de DNA. A dupla h\u00e9lice do DNA \u00e9 desnaturada por aquecimento, ap\u00f3s o qual fitas simples ficam dispon\u00edveis para processamento posterior. <\/p>\n\n<p>Em quatro outras prepara\u00e7\u00f5es id\u00eanticas, uma de cada uma das quatro bases \u00e9 adicionada como trifosfato de didesoxinucleos\u00eddeo (ddNTP). Estes ddNTPs de termina\u00e7\u00e3o de cadeia n\u00e3o t\u00eam um grupo 3&#8242;-hidroxi para ligar o grupo fosfato do pr\u00f3ximo nucleot\u00eddeo. Sua adi\u00e7\u00e3o \u00e0 fita rec\u00e9m-sintetizada interrompe a extens\u00e3o do DNA pela DNA polimerase por causa da falta do grupo OH.<\/p>\n\n<p> Como resultado, s\u00e3o produzidos fragmentos de DNA de diferentes comprimentos, que sempre terminam com o mesmo ddNTP em cada lote individual. <\/p>\n\n<p>Ap\u00f3s a rea\u00e7\u00e3o de sequencia\u00e7\u00e3o, os produtos de ruptura marcados de todas as abordagens s\u00e3o separados longitudinalmente por eletroforese em gel de poliacrilamida. <\/p>\n\n<p>A sequ\u00eancia pode ent\u00e3o ser lida em um filme fotogr\u00e1fico (filme de raios-X) ap\u00f3s a exposi\u00e7\u00e3o do gel radioativo. A sequ\u00eancia complementar correspondente \u00e9 a sequ\u00eancia do molde de DNA de fita simples usado. Atualmente, uma varia\u00e7\u00e3o da rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (PCR) \u00e9 utilizada como rea\u00e7\u00e3o de sequenciamento. <\/p>\n\n<p>Ao contr\u00e1rio da PCR, apenas um primer \u00e9 usado, de modo que o DNA \u00e9 amplificado apenas linearmente.<\/p>\n\n<p>No in\u00edcio dos anos 1980, Fritz M. Pohl e seu grupo de pesquisa desenvolveram um m\u00e9todo radioativo para o sequenciamento de DNA. Nesta tecnologia de sequenciamento, as mol\u00e9culas de DNA seriam transferidas para um transportador durante a separa\u00e7\u00e3o eletrofor\u00e9tica. <\/p>\n\n<p>O &#8220;Direct-Blotting-Electrophoresis System GATC 1500&#8221; foi comercializado pela empresa GATC Biotech, sediada em Constance. O sequenciador de DNA foi utilizado, por exemplo, no projeto genoma europeu para sequenciamento do cromossomo II da levedura.<em> Saccharomyces cerevisiae<\/em> .<\/p>\n\n<p>Desde o in\u00edcio de 1990, trifosfatos didesoxinucleos\u00eddeos marcados com corantes fluorescentes t\u00eam sido usados em particular. Cada um dos quatro ddNTPs \u00e9 acoplado a um corante diferente. Esta modifica\u00e7\u00e3o torna poss\u00edvel adicionar todos os quatro ddNTPs em um vaso de rea\u00e7\u00e3o. <\/p>\n\n<p>A divis\u00e3o em abordagens separadas e o manuseio de radiois\u00f3topos n\u00e3o s\u00e3o mais necess\u00e1rios. Os produtos de termina\u00e7\u00e3o de cadeia resultantes s\u00e3o separados por eletroforese capilar e excitados para fluoresc\u00eancia por um laser.<\/p>\n\n<p>Os ddNTPs no final de cada fragmento de DNA, portanto, mostram fluoresc\u00eancia de cores diferentes. Esta fluoresc\u00eancia pode ser detectada por um detector. O eletroferograma mostra diretamente a sequ\u00eancia de bases da fita sequenciada de DNA.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh5.googleusercontent.com\/yyZ_LR_fZ-94euUL4t6vX5lCWQ1W4uw1VoHq1jMUzzQVpDVHUUNHY9Hj5n_C7-cYtYgBEvwimFWHcva6WeuZNDXQ3OL6S0p62PoS2mO33PGJW-VV4DREdi5hmplZlVvpjkeqtHcW\" alt=\"Um fluxo de trabalho t&#xED;pico para sequenciamento Sanger. \" title=\"Sequenciamento Sanger\"\/><figcaption>Um fluxo de trabalho t\u00edpico para sequenciamento Sanger. Fonte da imagem: Estevezj, Wikimedia Commons<\/figcaption><\/figure>\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-modern-approaches\"><strong>Abordagens modernas<\/strong><\/h3>\n\n<p>Com a crescente import\u00e2ncia do sequenciamento de DNA em pesquisas e diagn\u00f3sticos, foram desenvolvidos m\u00e9todos que permitem o aumento do rendimento. Agora \u00e9 poss\u00edvel sequenciar o genoma humano completo em cerca de 8 dias. Os m\u00e9todos correspondentes s\u00e3o chamados de sequenciamento de segunda gera\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n<p> Diferentes empresas desenvolveram m\u00e9todos com diferentes vantagens e desvantagens. Al\u00e9m dos listados aqui, existem outros. O sequenciamento de DNA de segunda gera\u00e7\u00e3o foi nomeado o \u201cm\u00e9todo do ano 2007\u201d pela revista Nature Methods.<\/p>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-dna-sequencing-using-pyrosequencing\"><strong>Sequenciamento de DNA usando pirosequenciamento<\/strong><\/h4>\n\n<p>O pirosequenciamento usa uma DNA polimerase para sintetizar a contra-fita de DNA, embora o tipo de DNA polimerase ainda possa variar. <\/p>\n\n<p>A mistura de DNA \u00e9 ligada a um adaptador de DNA e acoplada a contas por meio de uma sequ\u00eancia de adaptador complementar. As contas carregadas com DNA s\u00e3o colocadas em uma placa com poros. A detec\u00e7\u00e3o depende de um detector de luz.<\/p>\n\n<p>A DNA polimerase \u00e9 observada &#8220;em a\u00e7\u00e3o&#8221; \u00e0 medida que anexa sucessivamente nucleot\u00eddeos individuais a uma fita de DNA rec\u00e9m-sintetizada. A inser\u00e7\u00e3o bem-sucedida de um nucleot\u00eddeo \u00e9 convertida em um sinal de luz que \u00e9 detectado por um detector. O DNA a ser sequenciado serve como uma fita de matriz e est\u00e1 dispon\u00edvel em uma forma de fita simples. <\/p>\n\n<p>O alongamento da fita de DNA \u00e9 feito pela adi\u00e7\u00e3o de um dos quatro tipos de trifosfatos de desoxinucleos\u00eddeo (dNTP) complementarmente. Quando o nucleot\u00eddeo apropriado \u00e9 adicionado, um sinal \u00e9 obtido. A adi\u00e7\u00e3o de um NTP inadequado n\u00e3o resulta em sinal detect\u00e1vel. Em seguida, o NTP existente \u00e9 destru\u00eddo e outro tipo \u00e9 adicionado; isso continua at\u00e9 que uma rea\u00e7\u00e3o seja mostrada novamente.<\/p>\n\n<p>Esta \u00e9 uma rea\u00e7\u00e3o mediada por enzima luciferase. Quando um nucleot\u00eddeo complementar \u00e9 incorporado pela DNA polimerase, o pirofosfato (PPi) \u00e9 liberado. O pirofosfato \u00e9 convertido em trifosfato de adenosina (ATP) pela ATP sulfurilase. <\/p>\n\n<p>O ATP conduz a rea\u00e7\u00e3o da luciferase, que converte a luciferina em oxiluciferina. Isso, por sua vez, resulta em um sinal de luz detect\u00e1vel &#8211; cuja intensidade \u00e9 proporcional ao ATP consumido.<\/p>\n\n<p>O pirosequenciamento tem sido usado para determinar a frequ\u00eancia de certas<a href=\"https:\/\/nebula.org\/blog\/pt-br\/genes\/\"> gene<\/a> muta\u00e7\u00f5es, por exemplo, na investiga\u00e7\u00e3o de doen\u00e7as gen\u00e9ticas. A pirosequenciamento pode ser facilmente automatizada e \u00e9 adequada para an\u00e1lises altamente paralelas de amostras de DNA.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh3.googleusercontent.com\/wIPpCnxtXE4qvkT4LYJyd0oKdFQwW55iw5ugmZsNTPidcqH39LRzxQZF63dXHox445puAPaxXoRhOSUchzeXNYySxAeriLYE4Hy7WZklh2n8Xu8VghRYLEXjEyryLddCM0_w8Fsr\" alt=\"Pirosequenciamento.\" title=\"Pirosequenciamento\"\/><figcaption>Pirosequenciamento. Fonte da imagem: Thisisjp, Wikimedia Commons<\/figcaption><\/figure>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-sequencing-by-hybridization\"><strong>Sequenciamento por hibridiza\u00e7\u00e3o<\/strong><\/h4>\n\n<p>Para tanto, se\u00e7\u00f5es curtas de DNA (oligonucleot\u00eddeos) s\u00e3o fixadas em fileiras e colunas em um suporte de vidro (chip de DNA ou microarray). <\/p>\n\n<p>Os fragmentos do DNA a serem sequenciados s\u00e3o marcados com corantes e aplicados \u00e0 matriz do oligonucleot\u00eddeo. Isso permite que as se\u00e7\u00f5es de DNA complementares fixas e livres hibridem umas com as outras. Depois de lavar os fragmentos n\u00e3o ligados, o padr\u00e3o de hibridiza\u00e7\u00e3o \u00e9 lido nos r\u00f3tulos de cores e sua for\u00e7a. <\/p>\n\n<p>As sequ\u00eancias dos oligonucleot\u00eddeos fixos e suas regi\u00f5es de sobreposi\u00e7\u00e3o s\u00e3o conhecidas. Conseq\u00fcentemente, o padr\u00e3o de cores pode ser usado para deduzir a sequ\u00eancia geral subjacente do DNA desconhecido.<\/p>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-ion-semiconductor-dna-sequencing-system\"><strong>Sistema de sequenciamento de DNA semicondutor de \u00edons<\/strong><\/h4>\n\n<p>o<a href=\"https:\/\/www.thermofisher.com\/nl\/en\/home\/brands\/ion-torrent.html\"> Ion Torrent<\/a> O m\u00e9todo usa tecnologia de chip semicondutor para realizar o sequenciamento n\u00e3o \u00f3ptico direto do genoma usando circuitos integrados. <\/p>\n\n<p>Os dados de sequencia\u00e7\u00e3o s\u00e3o obtidos diretamente da detec\u00e7\u00e3o de \u00edons produzidos por DNA polimerases dependentes de molde. O chip semicondutor usado neste m\u00e9todo tem um transistor de efeito de campo sens\u00edvel a \u00edons. Seus sensores est\u00e3o dispostos em uma grade de 1,2 milh\u00e3o de po\u00e7os nos quais ocorre a rea\u00e7\u00e3o da polimerase. Esta grade permite a detec\u00e7\u00e3o paralela e simult\u00e2nea de rea\u00e7\u00f5es de sequ\u00eancia independentes.<\/p>\n\n<p>\u00c9 usada a tecnologia complementar de semicondutor de \u00f3xido met\u00e1lico (CMOS), que permite uma rea\u00e7\u00e3o econ\u00f4mica em alta densidade de ponto de medi\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image is-resized\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh3.googleusercontent.com\/B5hrNL3q3yWRNkdCVqleutJQGyZQEmuxbKnFM8O5V4kw6OACKVSRhy16Y_xBacwQujfdPgROoem63z0NRuo6IA1u3z4yV66pWlrd5zQmXv_NGn0lAwm4FaDpn4jtYnvQPk1xfG7A\" alt=\"Tecnologia de sequenciamento de semicondutores de &#xED;ons, Fonte: Konrad Foerstner, Wikimedia Commons\" width=\"400\" height=\"300\" title=\"sequenciador de semicondutor\"\/><figcaption>Tecnologia de sequenciamento de semicondutores de \u00edons, Fonte: Konrad Foerstner, Wikimedia Commons<\/figcaption><\/figure>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-sequencing-with-bridge-synthesis\"><strong>Sequenciamento com s\u00edntese de ponte<\/strong><\/h4>\n\n<p>Essa tecnologia de sequenciamento \u00e9 conhecida como sequenciamento com s\u00edntese em ponte de Solexa \/ Illumina. O DNA de fita dupla a ser sequenciado \u00e9 ligado em ambas as extremidades com uma sequ\u00eancia adaptadora diferente em cada extremidade. <\/p>\n\n<p>O DNA \u00e9 ent\u00e3o desnaturado, ligado a uma placa transportadora em uma forma de fita simples ap\u00f3s dilui\u00e7\u00e3o. E ainda amplificado in situ por amplifica\u00e7\u00e3o de ponte. Isso cria \u00e1reas individuais (clusters) de DNA amplificado na placa transportadora, que t\u00eam a mesma sequ\u00eancia dentro de um cluster. <\/p>\n\n<p>A rea\u00e7\u00e3o de PCR \u00e9 com quatro substratos de termina\u00e7\u00e3o de cadeia fluorescentes de cores diferentes. A respectiva base incorporada por ciclo \u00e9 determinada em tempo real em um cluster.<\/p>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-two-base-encoding\"><strong>Codifica\u00e7\u00e3o de duas bases<\/strong><\/h4>\n\n<p>Sequenciamento por Detec\u00e7\u00e3o de Oligo Ligation (<a href=\"https:\/\/www.thermofisher.com\/nl\/en\/home\/life-science\/sequencing\/next-generation-sequencing\/solid-next-generation-sequencing\/solid-next-generation-sequencing-systems-reagents-accessories\/solid-next-generation-sequencing-chemistry.html\"> S\u00f3lido<\/a> ) da Applied Biosystems \u00e9 uma variante do Sequencing by Ligation. <\/p>\n\n<p>Uma biblioteca de DNA \u00e9 dilu\u00edda e acoplada a microesferas com uma DNA polimerase. O DNA \u00e9 ent\u00e3o amplificado em uma emuls\u00e3o PCR. Assim, cada microbead cont\u00e9m v\u00e1rias c\u00f3pias de uma \u00fanica sequ\u00eancia de DNA. As microesferas s\u00e3o modificadas na extremidade 3 &#8216;para que possam ser fixadas individualmente a uma placa de suporte.<\/p>\n\n<p> Ap\u00f3s a liga\u00e7\u00e3o do primer, quatro diferentes sondas cliv\u00e1veis s\u00e3o adicionadas, cada uma delas marcada com uma cor fluorescente diferente. Eles se ligam ao molde de DNA por meio dos dois primeiros nucleot\u00eddeos (CA, CT, GG, GC). Em seguida, as microp\u00e9rolas s\u00e3o ligadas a uma DNA ligase. As sondas s\u00e3o ent\u00e3o clivadas, liberando assim os r\u00f3tulos. <\/p>\n\n<p>Usando at\u00e9 cinco primers, cada base na sequ\u00eancia de DNA \u00e9 determinada em pelo menos duas rea\u00e7\u00f5es de liga\u00e7\u00e3o diferentes.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh4.googleusercontent.com\/-Ea1y8V90klItxRKEcwj3mBlVP3piFANgADdvOBiHBUZWHl6KTORTtpSbhxtefq2Smnrj-jpvbB3i0-jTVHpg-zp6GAweftqJ1ZHbKfraabzfNPZ-0fMZfB8lWdx3IZ7zzt8Ojwr\" alt=\"Plataforma SOLiD.\" title=\"Plataforma SOLiD\"\/><figcaption>Plataforma SOLiD, fonte da imagem: Philippe Hupe, Wikimedia Commons<\/figcaption><\/figure>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-dna-sequencing-with-paired-ends\"><strong>Sequenciamento de DNA com extremidades emparelhadas<\/strong><\/h4>\n\n<p>Um sinal claramente identific\u00e1vel pode ser obtido gerando pequenos peda\u00e7os de DNA a partir das extremidades terminais de uma sequ\u00eancia de DNA. Este m\u00e9todo de sequenciamento de DNA tamb\u00e9m \u00e9 conhecido como sequenciamento de tags de extremidade pareada, PETS.<\/p>\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-third-generation-dna-sequencing\"><strong>Sequenciamento de DNA de terceira gera\u00e7\u00e3o<\/strong><\/h3>\n\n<p>Pela primeira vez, o sequenciamento de terceira gera\u00e7\u00e3o mede a rea\u00e7\u00e3o em mol\u00e9culas \u00fanicas como um experimento de mol\u00e9cula \u00fanica. <\/p>\n\n<p>Isso elimina a necessidade de amplifica\u00e7\u00e3o por PCR antes do sequenciamento. As polimerases apresentam tend\u00eancia para a liga\u00e7\u00e3o a algumas sequ\u00eancias de DNA. Portanto, isso evita a amplifica\u00e7\u00e3o desigual por polimerases de DNA termoest\u00e1veis. <\/p>\n\n<p>Assim, algumas sequ\u00eancias podem ser ignoradas. Al\u00e9m disso, o genoma de uma c\u00e9lula individual pode ser examinado. <\/p>\n\n<p>O sinal liberado \u00e9 gravado em tempo real. No sequenciamento de DNA de terceira gera\u00e7\u00e3o, dois sinais diferentes s\u00e3o registrados, dependendo do m\u00e9todo utilizado. Eles s\u00e3o pr\u00f3tons ou fluor\u00f3foros liberados. O sequenciamento de DNA e RNA de c\u00e9lulas individuais foi denominado \u201cm\u00e9todo do ano 2013\u201d pela revista Nature Methods.<\/p>\n\n<figure class=\"wp-block-image is-resized\"><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/lh5.googleusercontent.com\/tTTe7UKvVeAuNV0RVKrh5tbuFfIeC1Uo10tAEqRz-UmkBpp_ejizHvA71b1rtLYy0oEqoikepDYGs16q-t-OGbdVrIeAybSxgPjCwHgbrPWGlBl_piOO4MbRhgwwdPp04Aq_kj9O\" alt=\"Tecnologia de sequenciamento de terceira gera&#xE7;&#xE3;o. Fonte da imagem: Chandra Shekhar Pareek, Rafal Smoczynski, Andrej Tretyn, Wikimedia Commons\" width=\"563\" height=\"386\" title=\"Sequenciamento de terceira gera&#xE7;&#xE3;o\"\/><figcaption>Tecnologia de sequenciamento de terceira gera\u00e7\u00e3o. Fonte da imagem: Chandra Shekhar Pareek, Rafal Smoczynski, Andrej Tretyn, Wikimedia Commons<\/figcaption><\/figure>\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\" id=\"h-nanopore-sequencing\"><strong>Sequenciamento de nanopore<\/strong><\/h4>\n\n<p><a href=\"https:\/\/nanoporetech.com\/applications\/dna-nanopore-sequencing\">Sequenciamento de nanopore<\/a> \u00e9 baseado em mudan\u00e7as no fluxo de \u00edons atrav\u00e9s de nanoporos embutidos em uma membrana criada artificialmente. Nanoporos s\u00e3o poros biol\u00f3gicos ou sint\u00e9ticos ou mesmo poros semissint\u00e9ticos. O nanopore est\u00e1 embutido em uma membrana artificial que possui uma resist\u00eancia el\u00e9trica particularmente alta. <\/p>\n\n<p>O poro est\u00e1 permanentemente aberto em contraste com os canais i\u00f4nicos comuns. Isso permite um fluxo constante de \u00edons atrav\u00e9s da membrana ap\u00f3s a aplica\u00e7\u00e3o de um potencial. As mol\u00e9culas de DNA que passam pelo poro levam a uma redu\u00e7\u00e3o da corrente. Essa redu\u00e7\u00e3o atual tem uma amplitude espec\u00edfica para cada nucleot\u00eddeo, que pode ser medida e atribu\u00edda ao nucleot\u00eddeo correspondente. <\/p>\n\n<p>No sequenciamento de fita simples, uma fita dupla de DNA \u00e9 separada por uma helicase e introduzida no nanopore. <\/p>\n\n<p>No caso de um poro MspA, quatro nucleot\u00eddeos do DNA est\u00e3o localizados simultaneamente dentro do poro. A velocidade de passagem depende, entre outras coisas, da diferen\u00e7a do valor do pH atrav\u00e9s da membrana. As mudan\u00e7as espec\u00edficas da corrente de \u00edons para cada um dos quatro nucleot\u00eddeos permitem que a sequ\u00eancia seja lida. <\/p>\n\n<p>Uma avalia\u00e7\u00e3o \u00e9 realizada, por exemplo, com o software Poretools. A vantagem desse m\u00e9todo \u00e9 que ele tem uma precis\u00e3o constante, mesmo com longas fitas de DNA. Uma varia\u00e7\u00e3o do m\u00e9todo \u00e9 usada para o sequenciamento de prote\u00ednas.<\/p>\n\n<p>A tecnologia de sequenciamento nanopore est\u00e1 sendo desenvolvida pela empresa brit\u00e2nica Oxford Nanopore Technologies. Seu sequenciador &#8220;MinION&#8221; estava inicialmente dispon\u00edvel apenas por meio de um &#8220;Programa de Acesso Antecipado&#8221;. Mas est\u00e1 dispon\u00edvel por meio de canais de distribui\u00e7\u00e3o convencionais desde 2015.<\/p>\n\n<p>Antes de sair, confira nossa pr\u00f3xima gera\u00e7\u00e3o baseada em sequenciamento<a href=\"https:\/\/nebula.org\/whole-genome-sequencing\/\"> Sequenciamento do genoma completo<\/a> !<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>O que \u00e9 sequenciamento de DNA? O sequenciamento de DNA \u00e9 um m\u00e9todo para determinar a ordem dos nucleot\u00eddeos em um DNA mol\u00e9cula. O sequenciamento de DNA revolucionou a gen\u00f4mica. 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