تسلسل الحمض النووي – تقنيات لقراءة كود الحياة

تسلسل الحمض النووي

ما هو تسلسل الحمض النووي؟

تسلسل الحمض النووي هو طريقة لتحديد ترتيب النيوكليوتيدات في الحمض النووي مركب. أحدث تسلسل الحمض النووي ثورة في علم الجينوم. منذ عام 1995 ، جعل تسلسل الحمض النووي من الممكن تحليل جينومات أكثر من 50000 (اعتبارًا من 2020) كائنات مختلفة.

إلى جانب طرق تحليل الحمض النووي الأخرى ، تُستخدم هذه التقنية أيضًا في فحص الأمراض الوراثية ، من بين أمور أخرى. علاوة على ذلك ، في سياق الاستنساخ الجزيئي ، أصبح تسلسل الحمض النووي أمرًا لا غنى عنه في البيولوجيا الجزيئية ومختبرات الهندسة الوراثية.

هل أنت مهتم بفك تشفير 100٪ من حمضك النووي؟ تقدم Nebula Genomics تسلسل الجينوم الكامل الأكثر تكلفة! ابدأ حياة من الاكتشاف مع الوصول الكامل إلى بيانات الجينوم الخاصة بك ، والتحديثات الأسبوعية بناءً على أحدث الاكتشافات العلمية ، وتحليل النسب المتقدم ، وأدوات استكشاف الجينوم القوية. انقر هنا لمعرفة المزيد!

حرره كريستينا سوردز ، دكتوراه.

تحديات تسلسل الحمض النووي

كان تحديد التسلسل البيولوجي مشكلة لم يتم حلها لعقود حتى منتصف السبعينيات عندما تم تطوير الطرق البيوكيميائية أو الجزيئية. في الوقت الحاضر ، حتى التسلسل الواسع النطاق للجينوم بأكمله أصبح سريعًا وسهلاً نسبيًا.

ومع ذلك ، فإن تحديات تسلسل الجينوم لا تقتصر فقط على القراءة المباشرة لتسلسل الحمض النووي. نظرًا للقيود التقنية ، تتم قراءة أقسام DNA القصيرة (تقرأ) حتى 1000 زوج أساسي في كل تفاعل تسلسلي فردي. بالنسبة لشريط طويل من الحمض النووي ، تم استخدام طريقة تُعرف باسم المشي التمهيدي لأول مرة في عام 1979. في هذا الإجراء ، تمت قراءة التسلسل قطعة قطعة.

في مشروع تسلسل أكبر ، فإن مشروع الشفرة الوراثية البشرية ، عدة مليارات من الأزواج الأساسية تم تسلسلها. تم ذلك من خلال نهج يعرف باسم تسلسل البندقية. اليوم ، نحن قادرون على دراسة الأمراض ، أهداف الأدوية ، التعريفات القائمة على الحمض النووي ، إلخ. بفضل تقنية تسلسل الحمض النووي المتوازية بشكل كبير.

في تسلسل البندقية ، يتم أولاً تقسيم خيط الحمض النووي إلى أجزاء أصغر من النيوكليوتيدات ، والتي يتم بعد ذلك تسلسل قاعدة تلو الأخرى. يتم بعد ذلك إعادة تجميع معلومات التسلسل الخاصة بالأجزاء القصيرة الفردية في جينوم كامل باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية.

يتم تحليل تسلسل البيانات الخام من أجل الحصول على المعلومات ذات الصلة بيولوجيًا. بدونها ، تبقى أي معلومات تسلسلية بدون قيمة علمية.

طرق التسلسل

تتوفر عدة طرق اليوم لقراءة معلومات تسلسل الحمض النووي باستخدام آلات التسلسل. لفترة طويلة ، تم تطوير أساليب التسلسل بناءً على تسلسل سانجر. توفر الأساليب الحديثة إمكانيات للتسلسل السريع من خلال التسلسل المتوازي للغاية. غالبًا ما يشار إلى طرق التسلسل الجديدة باسم تسلسل الجيل التالي.

الطرق الكلاسيكية

طريقة ماكسام وجيلبرت

تم تطوير هذه الطريقة من قبل آلان ماكسام ووالتر جيلبرت في عام 1977. لأنه يقوم على نهجين. الانقسام الكيميائي للقاعدة المحددة للحمض النووي والفصل اللاحق للأجزاء عن طريق تغيير طبيعة هلام البولي أكريلاميد الكهربائي.

يتم تمييز الحمض النووي أولاً عند نهاية 5 ‘أو 3’ بالفوسفات المشع أو مادة غير مشعة (البيوتين ، الفلورسين). في أربعة مستحضرات منفصلة ، يتم تعديل وتشكيل قواعد محددة من العمود الفقري للسكر والفوسفات في الحمض النووي جزئيًا (محدود). على سبيل المثال ، تتم ميثلة الجوانين الأساسي (G) بواسطة الكاشف كبريتات ثنائي ميثيل وتتم إزالته بالمعالجة القلوية بالبيبيريدين.

ثم يتم شق خيط الحمض النووي تمامًا. في كل إعداد ، يتم تشكيل شظايا ذات أطوال مختلفة ، والتي لطالما كانت نهايتها 3 ‘مشقوقة في قواعد معينة. يفصل الفصل الكهربي للهلام البولي أكريلاميد تغيير طبيعة الأجزاء وفقًا للطول ، مع حل الاختلافات في الطول بواسطة قاعدة واحدة. بمقارنة الطرق الأربعة على الهلام ، يمكن قراءة تسلسل الحمض النووي.

مكنت هذه الطريقة مخترعيها من تحديد تسلسل أوبرون الجينوم البكتيري. اليوم ، نادرًا ما تستخدم الطريقة لأنها تتطلب كواشف سامة. إلى جانب ذلك ، يعد التشغيل الآلي أكثر صعوبة من طريقة Sanger dideoxy المطورة في نفس الوقت.

نهج تسلسل ماكسام جيلبرت.
نهج تسلسل ماكسام جيلبرت. مصدر الصورة: JHCaufield، Wikimedia Commons

طريقة Dideoxy (Sanger التسلسل )

تسمى طريقة Sanger dideoxy أيضًا باسم تخليق إنهاء السلسلة. إنها طريقة إنزيمية. تم تطويره بواسطة Sanger and Coulson حوالي عام 1975. تم تقديمه في عام 1977 مع أول تسلسل كامل للجينوم (Bacteriophage φX174).

حصل سانجر على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1980 لعمله في تسلسل الحمض النووي. حصل على الجائزة مع والتر جيلبرت وبول بيرج.

الانزيم بوليميريز الحمض النووي يستخدم لإطالة أحد خيوط الحمض النووي التكميلية. يتم تغيير طبيعة الحلزون المزدوج للحمض النووي عن طريق التسخين ، وبعد ذلك تتوفر خيوط مفردة لمزيد من المعالجة.

في أربعة مستحضرات متطابقة بخلاف ذلك ، تتم إضافة واحدة من كل قاعدة من القواعد الأربع على شكل ثلاثي فوسفات ثنائي أكسيد النوكليوزيد (ddNTP). لا تحتوي ddNTPs التي تنتهي بالسلسلة على مجموعة 3-hydroxy لربط مجموعة الفوسفات الخاصة بالنيوكليوتيدات التالية. تؤدي إضافتهم إلى الخيط المركب حديثًا إلى إيقاف امتداد الحمض النووي بواسطة بوليميريز الحمض النووي بسبب فقدان مجموعة OH.

نتيجة لذلك ، يتم إنتاج أجزاء من الحمض النووي بأطوال مختلفة ، والتي تنتهي دائمًا بنفس ddNTP في كل دفعة فردية.

بعد تفاعل التسلسل ، يتم فصل منتجات الفصل المسمى من جميع الطرق طوليًا بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد.

يمكن بعد ذلك قراءة التسلسل على فيلم فوتوغرافي (فيلم الأشعة السينية) بعد التعرض للجيل المشع. التسلسل التكميلي المقابل هو تسلسل قالب DNA أحادي السلسلة المستخدم. في الوقت الحاضر ، يتم استخدام تباين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) كتفاعل تسلسلي.

على عكس PCR ، يتم استخدام أساس واحد فقط ، بحيث يتم تضخيم الحمض النووي خطيًا فقط.

في أوائل الثمانينيات ، طور فريتز إم. بول ومجموعته البحثية طريقة مشعة لتسلسل الحمض النووي. في تقنية التسلسل هذه ، سيتم نقل جزيئات الحمض النووي إلى ناقل أثناء الفصل الكهربي.

قامت شركة GATC Biotech التي تتخذ من مدينة كونستانس مقراً لها بتسويق “نظام التفريد المباشر والكهربائي GATC 1500”. تم استخدام مُسلسِل الحمض النووي ، على سبيل المثال ، في مشروع الجينوم الأوروبي لتسلسل الكروموسوم الثاني من الخميرة. خميرة الخميرة .

منذ أوائل التسعينيات ، تم استخدام ثلاثي الفوسفات ثنائي أكسيد النوكليوزيد المسمى بأصباغ الفلورسنت على وجه الخصوص. يقترن كل من ddNTPs الأربعة بصبغة مختلفة. يجعل هذا التعديل من الممكن إضافة جميع ddNTPs الأربعة في وعاء تفاعل واحد.

لم يعد الانقسام إلى مناهج منفصلة والتعامل مع النظائر المشعة ضروريًا. يتم فصل منتجات إنهاء السلسلة الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري ويتم تحفيزها لتتألق بواسطة الليزر.

وهكذا تظهر ddNTPs في نهاية كل جزء من الحمض النووي مضانًا بألوان مختلفة. يمكن الكشف عن هذا التألق بواسطة جهاز الكشف. يُظهر المخطط الكهربائي مباشرة تسلسل قواعد خيط DNA المتسلسل.

سير عمل نموذجي لتسلسل سانجر.
سير عمل نموذجي لتسلسل سانجر. مصدر الصورة: Estevezj، Wikimedia Commons

الأساليب الحديثة

مع تزايد أهمية تسلسل الحمض النووي في البحث والتشخيص ، تم تطوير طرق تسمح بزيادة الإنتاجية. من الممكن الآن تسلسل الجينوم البشري الكامل في حوالي 8 أيام. تسمى الطرق المقابلة تسلسل الجيل الثاني.

طورت الشركات المختلفة أساليب لها مزايا وعيوب مختلفة. بصرف النظر عن تلك المدرجة هنا ، هناك آخرون. تم تسمية تسلسل الحمض النووي من الجيل الثاني “طريقة العام 2007” من قبل مجلة Nature Methods.

تسلسل الحمض النووي باستخدام التسلسل الحراري

يستخدم Pyrosequencing بوليميراز DNA لتكوين خيط مضاد للحمض النووي ، على الرغم من أن نوع بوليميريز الحمض النووي يمكن أن يختلف.

يتم ربط خليط الحمض النووي بمحول DNA ويقترن بالخرز عبر تسلسل محول تكميلي. توضع الحبيبات المحملة بالحمض النووي على صفيحة ذات مسام. الكشف يعتمد على كاشف الضوء.

لوحظ أن بوليميريز الحمض النووي “يعمل” لأنه يربط على التوالي النيوكليوتيدات الفردية بحبل DNA المركب حديثًا. يتم تحويل الإدخال الناجح للنيوكليوتيدات إلى إشارة ضوئية يكتشفها الكاشف. يعمل الحمض النووي المراد تسلسله كحبل مصفوفة ومتوفر في شكل خيط واحد.

يتم إجراء استطالة خيط الحمض النووي عن طريق إضافة أحد الأنواع الأربعة من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوزيد (dNTP) بشكل متكامل. عند إضافة النوكليوتيدات المناسبة ، يتم الحصول على إشارة. لا ينتج عن إضافة NTP غير المناسب إشارة قابلة للاكتشاف. ثم يتم إتلاف NTP الموجود وإضافة نوع آخر ؛ يستمر هذا حتى يظهر رد فعل مرة أخرى.

هذا هو تفاعل لوسيفيراز بوساطة إنزيم. عندما يتم دمج نيوكليوتيد تكميلي بواسطة بوليميراز الدنا ، يتم تحرير بيروفوسفات (PPi). يتم تحويل البيروفوسفات إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة سلفوريلاز ATP.

يقوم ATP بتحريك تفاعل لوسيفيراز ، والذي يحول اللوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين. ينتج عن هذا بدوره إشارة ضوئية قابلة للاكتشاف – تتناسب قوتها مع ATP المستهلك.

تم استخدام Pyrosequencing لتحديد وتيرة معينة الجين الطفرات على سبيل المثال في التحقيق في الأمراض الوراثية. يمكن أتمتة Pyrosequencing بسهولة وهي مناسبة للتحليل المتوازي للغاية لعينات الحمض النووي.

بيروسيكينج.
بيروسيكينج. مصدر الصورة: Thisisjp، Wikimedia Commons

التسلسل عن طريق التهجين

لهذا الغرض ، يتم تثبيت أقسام قصيرة من الحمض النووي (قليل النوكليوتيدات) في صفوف وأعمدة على حامل زجاجي (شريحة DNA أو ميكروأري).

يتم تمييز أجزاء الحمض النووي المراد تسلسلها بالأصباغ ويتم تطبيقها على مصفوفة قليلة النوكليوتيد. هذا يسمح لأقسام الحمض النووي التكميلية الثابتة والحرة بالتهجين مع بعضها البعض. بعد غسل الأجزاء غير المنضمة ، تتم قراءة نمط التهجين من الملصقات الملونة وقوتها.

تسلسل قليل النوكليوتيدات الثابتة ومناطقها المتداخلة معروفة. وبالتالي ، يمكن استخدام نمط اللون في النهاية لاستنتاج التسلسل العام الأساسي للحمض النووي غير المعروف.

نظام تسلسل الحمض النووي لأشباه الموصلات الأيونية

ال ايون تورنت تستخدم الطريقة تقنية شرائح أشباه الموصلات لإجراء تسلسل الجينوم غير البصري المباشر باستخدام الدوائر المتكاملة.

يتم الحصول على بيانات التسلسل مباشرة من اكتشاف الأيونات التي تنتجها بوليميراز DNA المعتمد على القالب. تحتوي شريحة أشباه الموصلات المستخدمة في هذه الطريقة على ترانزستور ذو تأثير مجال حساس للأيونات. مستشعراتها مرتبة في شبكة من 1.2 مليون بئر يحدث فيها تفاعل البوليميراز. تتيح هذه الشبكة الكشف المتوازي والمتزامن لتفاعلات التسلسل المستقل.

يتم استخدام تقنية أشباه الموصلات – أكسيد المعادن التكميلية (CMOS) ، والتي تسمح بتفاعل فعال من حيث التكلفة عند كثافة نقطة قياس عالية.

تقنية تسلسل أشباه الموصلات الأيونية ، المصدر: Konrad Foerstner ، ويكيميديا كومنز
تقنية تسلسل أشباه الموصلات الأيونية ، المصدر: Konrad Foerstner ، ويكيميديا كومنز

التسلسل مع تركيب الجسر

تُعرف تقنية التسلسل هذه باسم التسلسل باستخدام جسر توليف Solexa / Illumina. يتم ربط الحمض النووي مزدوج الشريطة المراد تسلسله عند كلا الطرفين بتسلسل محول مختلف في كل طرف.

يتم بعد ذلك تغيير طبيعة الحمض النووي ، وربطه على صفيحة حاملة في شكل أحادي الخيط بعد التخفيف. ومزيد من التضخيم في الموقع عن طريق تضخيم الجسر. يؤدي هذا إلى إنشاء مناطق فردية (مجموعات) من الحمض النووي المتضخم على اللوحة الحاملة ، والتي لها نفس التسلسل داخل الكتلة.

يكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع أربعة ركائز متوهجة ذات ألوان مختلفة لإنهاء السلسلة. يتم تحديد القاعدة المعنية المدمجة في كل دورة في الوقت الفعلي في مجموعة.

ترميز ثنائي القاعدة

التسلسل عن طريق كشف ربط Oligo ( صلب ) من Applied Biosystems هو أحد أشكال التسلسل بواسطة Ligation.

تُخفف مكتبة الحمض النووي وتُقرن بميكروبيدات ببوليميراز DNA. ثم يتم تضخيم الحمض النووي في مستحلب PCR. وهكذا ، يحتوي كل ميكروبيد على عدة نسخ من تسلسل DNA واحد. يتم تعديل الميكروبيدات في الطرف الثالث بحيث يمكن ربطها بشكل فردي بلوحة حاملة.

بعد الربط التمهيدي ، تتم إضافة أربعة مجسات مختلفة قابلة للانقسام ، كل منها مميز بلون فلورسنت مختلف. ترتبط بقالب الحمض النووي عن طريق النيوكليوتيدات الأولين (CA ، CT ، GG ، GC). بعد ذلك ، يتم ربط الميكروبيدات بـ DNA ligase. ثم يتم شق المجسات ، وبالتالي تحرير الملصقات.

باستخدام ما يصل إلى خمسة بادئات ، يتم تحديد كل قاعدة في تسلسل الحمض النووي في تفاعلين ربط مختلفين على الأقل.

منصة SOLiD.
منصة SOLiD ، مصدر الصورة: فيليب هوبي ، ويكيميديا كومنز

تسلسل الحمض النووي بنهايات مقترنة

يمكن الحصول على إشارة يمكن تحديدها بوضوح عن طريق توليد قطع قصيرة من الحمض النووي من الأطراف النهائية لتسلسل الحمض النووي. تُعرف طريقة تسلسل الحمض النووي هذه أيضًا باسم تسلسل العلامات المزدوجة ، PETS.

تسلسل الجيل الثالث من الحمض النووي

لأول مرة ، يقيس تسلسل الجيل الثالث التفاعل في جزيئات مفردة كتجربة جزيء واحد.

هذا يلغي الحاجة إلى التضخيم بواسطة PCR قبل التسلسل. تظهر البوليمرات تحيزًا للارتباط ببعض تسلسلات الحمض النووي. ومن ثم فإن هذا يتجنب التضخيم غير المتكافئ بواسطة بوليميراز DNA المقاوم للحرارة.

وبالتالي ، يمكن التغاضي عن بعض التسلسلات. علاوة على ذلك ، يمكن فحص جينوم الخلية الفردية.

يتم تسجيل الإشارة الصادرة في الوقت الفعلي. في تسلسل الحمض النووي من الجيل الثالث ، يتم تسجيل إشارتين مختلفتين ، اعتمادًا على الطريقة المستخدمة. يتم إطلاقها البروتونات أو الفلوروفور. تم تسمية تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي للخلايا الفردية “طريقة العام 2013” من قبل مجلة Nature Methods.

تقنية تسلسل الجيل الثالث. مصدر الصورة: شاندرا شيخار باريك ، رافال سموزينسكي ، أندريه تريتين ، ويكيميديا كومنز
تقنية تسلسل الجيل الثالث. مصدر الصورة: شاندرا شيخار باريك ، رافال سموزينسكي ، أندريه تريتين ، ويكيميديا كومنز

تسلسل Nanopore

تسلسل Nanopore يعتمد على التغيرات في تدفق الأيونات عبر المسام النانوية المدمجة في غشاء مصطنع. المسام النانوية هي مسام بيولوجية أو صناعية أو حتى مسام شبه صناعية. يتم تضمين ثقب النانو في غشاء اصطناعي يتمتع بمقاومة كهربائية عالية بشكل خاص.

يتم فتح المسام بشكل دائم على عكس القنوات الأيونية العادية. يسمح هذا بالتدفق المستمر للأيونات عبر الغشاء بعد تطبيق الجهد. تؤدي جزيئات الحمض النووي التي تمر عبر المسام إلى تقليل التيار. هذا التخفيض الحالي له سعة محددة لكل نيوكليوتيد ، والتي يمكن قياسها وتخصيصها للنيوكليوتيدات المقابلة.

في التسلسل أحادي الخيط ، يتم فصل خيط DNA مزدوج الشريطة بواسطة هليكاز ويتم إدخاله في ثقب النانو.

في حالة مسام MspA ، توجد أربعة نيوكليوتيدات للحمض النووي في نفس الوقت داخل المسام. تعتمد سرعة المرور ، من بين أمور أخرى ، على اختلاف قيمة الأس الهيدروجيني عبر الغشاء. تسمح التغيرات الحالية الأيونية لكل من النيوكليوتيدات الأربعة بقراءة التسلسل.

يتم إجراء تقييم ، على سبيل المثال ، باستخدام برنامج Poretools. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنها تتمتع بدقة ثابتة حتى مع خيوط الحمض النووي الطويلة. يتم استخدام طريقة مختلفة لتسلسل البروتين.

يتم تطوير تقنية تسلسل المسامير النانوية من قبل شركة أكسفورد نانوبور تكنولوجيز البريطانية. كان جهاز التسلسل “MinION” متاحًا في البداية فقط من خلال “برنامج الوصول المبكر”. لكنها كانت متاحة من خلال قنوات التوزيع التقليدية منذ عام 2015.

قبل أن تغادر ، تحقق من الجيل التالي القائم على التسلسل تسلسل الجينوم الكامل !