DNA-Sequenzierung – Technologien zum Lesen des Lebenscodes

DNA-Sequenzierung

Was ist DNA-Sequenzierung?

Die DNA-Sequenzierung ist eine Methode zur Bestimmung der Reihenfolge der Nukleotide in a DNA Molekül. Die DNA-Sequenzierung hat die Genomik revolutioniert. Seit 1995 ermöglicht die DNA-Sequenzierung die Analyse der Genome von über 50.000 (ab 2020) verschiedenen Organismen.

Zusammen mit anderen DNA-Analysemethoden wird diese Technik unter anderem auch zur Untersuchung genetischer Erkrankungen eingesetzt. Darüber hinaus ist im Zusammenhang mit der molekularen Klonierung die DNA-Sequenzierung in molekularbiologischen und gentechnischen Labors unverzichtbar geworden.

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Herausgegeben von Christina Swords, Ph.D.

Die Herausforderungen der DNA-Sequenzierung

Die Bestimmung der biologischen Sequenzen war jahrzehntelang ein ungelöstes Problem, bis Mitte der 1970er Jahre biochemische oder molekulare Methoden entwickelt wurden. Heutzutage ist sogar die groß angelegte Sequenzierung ganzer Genome vergleichsweise schnell und einfach geworden.

Die Herausforderungen der Genomsequenzierung beschränken sich jedoch nicht nur auf das direkte Ablesen der Nukleinsäuresequenz. Aufgrund technischer Einschränkungen werden in jeder einzelnen Sequenzierungsreaktion nur kurze DNA-Schnitte (Reads) bis zu 1000 Basenpaare gelesen. Für einen langen DNA-Strang wurde erstmals 1979 eine als Primer Walking bekannte Methode angewendet. Bei diesem Verfahren wurde die Sequenz Stück für Stück gelesen.

In einem größeren Sequenzierungsprojekt wird die Humangenomprojekt wurden mehrere Milliarden Basenpaare sequenziert. Dies wurde durch einen Ansatz erreicht, der als Shotgun-Sequenzierung bekannt ist. Heute sind wir in der Lage, Krankheiten, Wirkstofftargets, DNA-basierte Identifikationen usw. zu untersuchen. Dank der massiv parallelen DNA-Sequenzierungstechnologie.

Bei der Shotgun-Sequenzierung wird der DNA-Strang zunächst in kleinere Fragmente von Nukleotiden zerlegt, die dann Base für Base sequenziert werden. Die Sequenzinformationen der einzelnen kurzen Segmente werden dann unter Verwendung von Bioinformatik-Werkzeugen zu einem vollständigen Genom zusammengesetzt.

Die Rohdatensequenz wird analysiert, um biologisch relevante Informationen zu erhalten. Ohne sie bleibt jede Sequenzinformation ohne wissenschaftlichen Wert.

Sequenzierungsmethoden

Heute stehen verschiedene Methoden zum Lesen der DNA-Sequenzinformationen mit Sequenziergeräten zur Verfügung. Die Entwicklung der Sequenzierungsmethoden basierte lange Zeit auf der Sanger-Sequenzierung. Moderne Methoden bieten Möglichkeiten für eine beschleunigte Sequenzierung durch hochparallele Sequenzierung. Die neuen Sequenzierungsmethoden werden häufig als Sequenzierung der nächsten Generation bezeichnet.

Klassische Methoden

Methode von Maxam und Gilbert

Die Methode wurde 1977 von Allan Maxam und Walter Gilbert entwickelt. Es basiert auf zwei Ansätzen. Die basenspezifische chemische Spaltung von DNA und anschließende Trennung der Fragmente durch Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Die DNA wird zuerst an einem 5′- oder 3′-Ende mit radioaktivem Phosphat oder einer nicht radioaktiven Substanz (Biotin, Fluorescein) markiert. In vier getrennten Präparationen werden dann spezifische Basen aus dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA teilweise (begrenzt) modifiziert und gespalten. Beispielsweise wird die Base Guanin (G) durch das Reagenz Dimethylsulfat methyliert und durch Alkalibehandlung mit Piperidin entfernt.

Der DNA-Strang wird dann vollständig gespalten. In jeder Präparation werden Fragmente unterschiedlicher Länge gebildet, deren 3′-Ende immer an bestimmten Basen gespalten wurde. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt die Fragmente nach Länge, wobei Längenunterschiede durch eine Base aufgelöst werden. Durch Vergleichen der vier Ansätze auf dem Gel kann die Sequenz der DNA abgelesen werden.

Dieses Verfahren ermöglichte es seinen Erfindern, die Operonsequenz eines Bakteriengenoms zu bestimmen. Heutzutage wird die Methode selten angewendet, da sie toxische Reagenzien erfordert. Außerdem ist es schwieriger zu automatisieren als die gleichzeitig entwickelte Sanger-Didesoxy-Methode.

Maxam Gilbert Sequenzierungsansatz.
Maxam Gilbert Sequenzierungsansatz. Bildquelle: JHCaufield, Wikimedia Commons

Didesoxy-Methode (Sanger Sequenzierung )

Die Sanger-Didesoxy-Methode wird auch als Kettenabbruchsynthese bezeichnet. Es ist eine enzymatische Methode. Es wurde von Sanger und Coulson um 1975 entwickelt. Es wurde 1977 mit der ersten vollständigen Sequenz eines Genoms (Bakteriophage φX174) vorgestellt.

Sanger erhielt 1980 den Nobelpreis für Chemie für seine Arbeiten zur DNA-Sequenzierung. Er erhielt den Preis zusammen mit Walter Gilbert und Paul Berg.

Das Enzym DNA-Polymerase wird verwendet, um einen der beiden komplementären DNA-Stränge zu verlängern. Die DNA-Doppelhelix wird durch Erhitzen denaturiert, wonach Einzelstränge zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung stehen.

In vier ansonsten identischen Präparaten wird jeweils eine der vier Basen als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugesetzt. Diese kettenterminierenden ddNTPs haben keine 3′-Hydroxygruppe, um die Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids zu verbinden. Ihre Zugabe in den neu synthetisierten Strang stoppt die DNA-Verlängerung durch die DNA-Polymerase aufgrund der fehlenden OH-Gruppe.

Als Ergebnis entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jeder einzelnen Charge immer mit dem gleichen ddNTP enden.

Nach der Sequenzierungsreaktion werden die markierten Abbruchprodukte aus allen Ansätzen durch Polyacrylamidgelelektrophorese der Länge nach getrennt.

Die Sequenz kann dann nach Belichtung des radioaktiven Gels auf einem fotografischen Film (Röntgenfilm) abgelesen werden. Die entsprechende komplementäre Sequenz ist die Sequenz der verwendeten einzelsträngigen DNA-Matrize. Heutzutage wird eine Variation der Polymerasekettenreaktion (PCR) als Sequenzierungsreaktion verwendet.

Im Gegensatz zur PCR wird nur ein Primer verwendet, so dass die DNA nur linear amplifiziert wird.

In den frühen 1980er Jahren entwickelten Fritz M. Pohl und seine Forschungsgruppe eine radioaktive Methode zur DNA-Sequenzierung. Bei dieser Sequenzierungstechnologie würden DNA-Moleküle während der elektrophoretischen Trennung auf einen Träger übertragen.

Das “Direct-Blot-Elektrophoresesystem GATC 1500” wurde von der in Konstanz ansässigen Firma GATC Biotech vermarktet. Der DNA-Sequenzierer wurde beispielsweise im europäischen Genomprojekt zur Sequenzierung von Chromosom II der Hefe verwendet Saccharomyces cerevisiae .

Seit den frühen neunziger Jahren werden insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Didesoxynukleosidtriphosphate verwendet. Jedes der vier ddNTPs ist mit einem anderen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation ermöglicht es, alle vier ddNTPs in ein Reaktionsgefäß zu geben.

Die Aufteilung in separate Ansätze und der Umgang mit Radioisotopen ist nicht mehr erforderlich. Die resultierenden Kettenabbruchprodukte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt und durch einen Laser zur Fluoreszenz angeregt.

Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragments zeigen somit eine Fluoreszenz unterschiedlicher Farben. Diese Fluoreszenz kann von einem Detektor erfasst werden. Das Elektropherogramm zeigt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Strangs.

Ein typischer Workflow für die Sanger-Sequenzierung.
Ein typischer Workflow für die Sanger-Sequenzierung. Bildquelle: Estevezj, Wikimedia Commons

Moderne Ansätze

Mit der zunehmenden Bedeutung der DNA-Sequenzierung in Forschung und Diagnostik wurden Methoden entwickelt, die einen erhöhten Durchsatz ermöglichen. Es ist nun möglich, das gesamte menschliche Genom in etwa 8 Tagen zu sequenzieren. Die entsprechenden Methoden werden als Sequenzierung der zweiten Generation bezeichnet.

Verschiedene Unternehmen haben Methoden mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen entwickelt. Neben den hier aufgeführten gibt es noch andere. Die DNA-Sequenzierung der zweiten Generation wurde von der Zeitschrift Nature Methods als „Methode des Jahres 2007“ ausgezeichnet.

DNA-Sequenzierung mittels Pyrosequenzierung

Bei der Pyrosequenzierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um den DNA-Gegenstrang zu synthetisieren, obwohl der Typ der DNA-Polymerase immer noch variieren kann.

Das DNA-Gemisch wird mit einem DNA-Adapter ligiert und über eine komplementäre Adaptersequenz an Perlen gekoppelt. Die mit DNA beladenen Perlen werden auf eine Platte mit Poren gelegt. Die Erkennung ist abhängig von einem Lichtdetektor.

Die DNA-Polymerase wird “in Aktion” beobachtet, wenn sie nacheinander einzelne Nukleotide an einen neu synthetisierten DNA-Strang bindet. Die erfolgreiche Insertion eines Nukleotids wird in ein Lichtsignal umgewandelt, das von einem Detektor erfasst wird. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrixstrang und ist in Einzelstrangform erhältlich.

Die DNA-Strangverlängerung erfolgt durch komplementäre Zugabe einer der vier Arten von Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP). Wenn das geeignete Nukleotid hinzugefügt wird, wird ein Signal erhalten. Das Hinzufügen eines ungeeigneten NTP führt nicht zu einem erkennbaren Signal. Dann wird das vorhandene NTP zerstört und ein anderer Typ hinzugefügt. Dies setzt sich fort, bis wieder eine Reaktion angezeigt wird.

Dies ist eine Luciferase-Enzym-vermittelte Reaktion. Wenn ein komplementäres Nukleotid von der DNA-Polymerase eingebaut wird, wird Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Das Pyrophosphat wird durch ATP-Sulfurylase in Adenosintriphosphat (ATP) umgewandelt.

Das ATP steuert die Luciferase-Reaktion, die Luciferin in Oxyluciferin umwandelt. Dies führt wiederum zu einem nachweisbaren Lichtsignal, dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist.

Pyrosequenzierung wurde verwendet, um die Häufigkeit bestimmter zu bestimmen Gen Mutationen zB bei der Untersuchung genetisch bedingter Krankheiten. Die Pyrosequenzierung kann leicht automatisiert werden und eignet sich für die hochparallele Analyse von DNA-Proben.

Pyrosequenzierung.
Pyrosequenzierung. Bildquelle: Thisisjp, Wikimedia Commons

Sequenzierung durch Hybridisierung

Zu diesem Zweck werden kurze DNA-Schnitte (Oligonukleotide) in Reihen und Spalten auf einem Glasträger (DNA-Chip oder Microarray) fixiert.

Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und auf die Oligonukleotidmatrix aufgetragen. Dies ermöglicht es den komplementären fixierten und freien DNA-Schnitten, miteinander zu hybridisieren. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente wird das Hybridisierungsmuster von den Farbetiketten und ihrer Stärke abgelesen.

Die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und ihrer überlappenden Regionen sind bekannt. Daher kann das Farbmuster letztendlich verwendet werden, um die zugrunde liegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA abzuleiten.

Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem

Das Ion Torrent Das Verfahren verwendet die Halbleiterchip-Technologie, um eine direkte nichtoptische Genomsequenzierung unter Verwendung integrierter Schaltkreise durchzuführen.

Sequenzierungsdaten werden direkt aus dem Nachweis von Ionen erhalten, die von templatabhängigen DNA-Polymerasen erzeugt werden. Der bei diesem Verfahren verwendete Halbleiterchip weist einen ionenempfindlichen Feldeffekttransistor auf. Seine Sensoren sind in einem Raster von 1,2 Millionen Vertiefungen angeordnet, in denen die Polymerasereaktion stattfindet. Dieses Gitter ermöglicht die parallele und gleichzeitige Erfassung unabhängiger Sequenzreaktionen.

Es wird eine komplementäre Metalloxid-Halbleiter (CMOS) -Technologie verwendet, die eine kostengünstige Reaktion bei hoher Messpunktdichte ermöglicht.

Ionenhalbleiter-Sequenzierungstechnologie, Quelle: Konrad Foerstner, Wikimedia Commons
Ionenhalbleiter-Sequenzierungstechnologie, Quelle: Konrad Foerstner, Wikimedia Commons

Sequenzierung mit Brückensynthese

Diese Sequenzierungstechnologie ist als Sequenzierung mit Brückensynthese von Solexa / Illumina bekannt. Die zu sequenzierende doppelsträngige DNA wird an beiden Enden mit einer unterschiedlichen Adaptersequenz an jedem Ende ligiert.

Die DNA wird dann denaturiert und nach Verdünnung in einzelsträngiger Form auf eine Trägerplatte ligiert. Und in situ durch Brückenverstärkung weiter verstärkt. Dadurch entstehen einzelne Bereiche (Cluster) amplifizierter DNA auf der Trägerplatte, die innerhalb eines Clusters dieselbe Sequenz aufweisen.

Die PCR-Reaktion erfolgt mit vier verschiedenfarbigen fluoreszierenden kettenendenden Substraten. Die jeweilige Basis pro Zyklus wird in Echtzeit in einem Cluster ermittelt.

Zwei-Basen-Codierung

Sequenzierung durch Oligo Ligation Detection ( Solide ) von Applied Biosystems ist eine Variante der Sequenzierung durch Ligation.

Eine DNA-Bibliothek wird verdünnt und mit einer DNA-Polymerase an Mikrokügelchen gekoppelt. Die DNA wird dann in einer Emulsions-PCR amplifiziert. Somit enthält jede Mikrokügelchen mehrere Kopien einer einzelnen DNA-Sequenz. Die Mikrokügelchen sind am 3′-Ende so modifiziert, dass sie einzeln an einer Trägerplatte befestigt werden können.

Nach der Primerbindung werden vier verschiedene spaltbare Sonden hinzugefügt, von denen jede mit einer anderen fluoreszierenden Farbe markiert ist. Sie binden mittels der ersten beiden Nukleotide (CA, CT, GG, GC) an die DNA-Matrize. Als nächstes werden die Mikrokügelchen mit einer DNA-Ligase ligiert. Die Sonden werden dann gespalten, wodurch die Markierungen freigegeben werden.

Unter Verwendung von bis zu fünf Primern wird jede Base in der DNA-Sequenz in mindestens zwei verschiedenen Ligationsreaktionen bestimmt.

SOLiD-Plattform.
SOLiD-Plattform, Bildquelle: Philippe Hupe, Wikimedia Commons

DNA-Sequenzierung mit gepaarten Enden

Ein klar identifizierbares Signal kann erhalten werden, indem kurze DNA-Stücke aus den terminalen Enden einer DNA-Sequenz erzeugt werden. Dieses DNA-Sequenzierungsverfahren ist auch als Paired-End-Tag-Sequenzierung, PETS, bekannt.

DNA-Sequenzierung der dritten Generation

Zum ersten Mal misst die Sequenzierung der dritten Generation die Reaktion in Einzelmolekülen als Einzelmolekülexperiment.

Dies eliminiert die Notwendigkeit einer Amplifikation durch PCR vor der Sequenzierung. Polymerasen zeigen eine Tendenz zur Bindung an einige DNA-Sequenzen. Dadurch wird eine ungleichmäßige Amplifikation durch thermostabile DNA-Polymerasen vermieden.

Somit können einige Sequenzen übersehen werden. Weiterhin kann das Genom einer einzelnen Zelle untersucht werden.

Das freigegebene Signal wird in Echtzeit aufgezeichnet. Bei der DNA-Sequenzierung der dritten Generation werden je nach verwendeter Methode zwei verschiedene Signale aufgezeichnet. Sie sind freigesetzte Protonen oder Fluorophore. Die DNA- und RNA-Sequenzierung einzelner Zellen wurde von der Zeitschrift Nature Methods als „Methode des Jahres 2013“ ausgezeichnet.

Sequenzierungstechnologie der dritten Generation. Bildquelle: Chandra Shekhar Pareek, Rafal Smoczynski, Andrej Tretyn, Wikimedia Commons
Sequenzierungstechnologie der dritten Generation. Bildquelle: Chandra Shekhar Pareek, Rafal Smoczynski, Andrej Tretyn, Wikimedia Commons

Nanoporen-Sequenzierung

Nanoporen-Sequenzierung basiert auf Änderungen des Ionenflusses durch Nanoporen, die in eine künstlich erzeugte Membran eingebettet sind. Nanoporen sind biologische oder synthetische Poren oder sogar halbsynthetische Poren. Die Nanopore ist in eine künstliche Membran eingebettet, die einen besonders hohen elektrischen Widerstand aufweist.

Die Pore ist im Gegensatz zu gewöhnlichen Ionenkanälen permanent offen. Dies ermöglicht einen konstanten Ionenfluss durch die Membran nach dem Anlegen eines Potentials. DNA-Moleküle, die durch die Pore gelangen, führen zu einer Verringerung des Stroms. Diese Stromreduzierung hat für jedes Nukleotid eine spezifische Amplitude, die gemessen und dem entsprechenden Nukleotid zugeordnet werden kann.

Bei der Einzelstrangsequenzierung wird ein doppelsträngiger DNA-Strang durch eine Helikase getrennt und in die Nanopore eingeführt.

Im Fall einer MspA-Pore befinden sich gleichzeitig vier Nukleotide der DNA innerhalb der Pore. Die Durchgangsgeschwindigkeit hängt unter anderem von der pH-Wertdifferenz über die Membran ab. Die spezifischen Ionenstromänderungen für jedes der vier Nukleotide ermöglichen das Ablesen der Sequenz.

Eine Auswertung erfolgt beispielsweise mit der Poretools-Software. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie auch bei langen DNA-Strängen eine konstante Genauigkeit aufweist. Eine Variation des Verfahrens wird zur Proteinsequenzierung verwendet.

Die Nanoporen-Sequenzierungstechnologie wird von der britischen Firma Oxford Nanopore Technologies weiterentwickelt. Ihr “MinION” -Sequenzer war ursprünglich nur über ein “Early Access Program” erhältlich. Es ist jedoch seit 2015 über herkömmliche Vertriebskanäle erhältlich.

Bevor Sie losfahren, sehen Sie sich unsere Sequenzierung auf Basis der nächsten Generation an Sequenzierung des gesamten Genoms !