DNAシーケンシング-生命のコードを読み取る技術

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DNAシーケンシングとは何ですか?

DNAシーケンシングは、ヌクレオチドの順序を決定する方法です。 DNA分子。 DNAシーケンシングはゲノミクスに革命をもたらしました。 1995年以来、DNAシーケンシングにより、50,000を超える(2020年現在)さまざまな生物のゲノムを分析することが可能になりました。

この手法は、他のDNA分析手法とともに、とりわけ遺伝病の調査にも使用されます。 さらに、分子クローニングの文脈では、DNAシーケンシングは分子生物学および遺伝子工学の実験室で不可欠になっています。

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Christina Swords、Ph.D。が編集

DNAシーケンシングの課題

生化学的または分子的方法が開発された1970年代半ばまで、生物学的配列の決定は何十年もの間未解決の問題でした。 今日では、ゲノム全体の大規模なシーケンスでさえ、比較的高速で簡単になっています。

ただし、ゲノムシーケンシングの課題は、核酸配列を直接読み取ることだけに限定されません。 技術的な制限により、個々のシーケンス反応では、最大1000塩基対の短いDNAセクション(読み取り)のみが読み取られます。 DNAの長い鎖については、プライマーウォーキングとして知られる方法が1979年に最初に使用されました。 この手順では、シーケンスを1つずつ読み取りました。

大規模なシーケンスプロジェクトでは、ヒトゲノムプロジェクト、数十億の塩基対がシーケンスされました。 これは、ショットガンシーケンシングとして知られるアプローチによって行われました。 今日、私たちは病気、創薬ターゲット、DNAベースの同定などを研究することができます。 超並列DNAシーケンシングテクノロジーのおかげです。

ショットガンシーケンシングでは、DNA鎖は最初にヌクレオチドの小さなフラグメントに分解され、次に塩基ごとにシーケンシングされます。 次に、個々の短いセグメントの配列情報は、バイオインフォマティクスツールを使用して完全なゲノムに再構築されます。

生物学的に関連する情報を取得するために、生データシーケンスが分析されます。 それがなければ、配列情報は科学的価値がないままです。

シーケンシング方法

シーケンシングマシンを使用してDNA配列情報を読み取るために、今日いくつかの方法が利用可能です。 長い間、シーケンス手法の開発はサンガーシーケンスに基づいて構築されていました。 最新の方法は、高度に並列化されたシーケンスを通じて高速シーケンスの可能性を提供します。 新しいシーケンシング方法は、しばしば次世代シーケンシングと呼ばれます。

古典的な方法

マクサムとギルバートの方法

この方法は、1977年にAllanMaxamとWalterGilbertによって開発されました。 これは2つのアプローチに基づいています。 DNAの塩基特異的な化学的切断とそれに続く変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるフラグメントの分離。

DNAは、最初に5 ‘または3’末端で放射性リン酸塩または非放射性物質(ビオチン、フルオレセイン)で標識されます。 次に、4つの別々の調製物で、DNAの糖リン酸骨格からの特定の塩基が部分的に(限定的に)修飾され、切断されます。 たとえば、塩基性グアニン(G)は、試薬の硫酸ジメチルによってメチル化され、ピペリジンによるアルカリ処理によって除去されます。

その後、DNA鎖は完全に切断されます。 各調製物では、異なる長さの断片が形成され、その3 ‘末端は常に特定の塩基で切断されています。 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、長さに従ってフラグメントを分離し、長さの違いは1塩基で解決されます。 ゲル上の4つのアプローチを比較することにより、DNAの配列を読み取ることができます。

この方法により、発明者は細菌ゲノムのオペロン配列を決定することができました。 今日、この方法は有毒な試薬を必要とするため、ほとんど使用されていません。 さらに、同時に開発されたサンガージデオキシ法よりも自動化が困難です。

MaxamGilbertシーケンスアプローチ。
MaxamGilbertシーケンスアプローチ。 画像ソース:JHCaufield、ウィキメディアコモンズ

ジデオキシ法(サンガーシーケンシング

サンガージデオキシ法は、連鎖停止合成とも呼ばれます。 酵素法です。 1975年頃にSangerandCoulsonによって開発されました。 1977年に、ゲノムの最初の完全な配列(バクテリオファージφX174)とともに発表されました。

サンガーは、DNAシーケンシングの研究で1980年にノーベル化学賞を受賞しました。 彼はウォルターギルバートとポールバーグと一緒に賞を受賞しました。

酵素DNAポリメラーゼ2つの相補的DNA鎖の1つを長くするために使用されます。 DNA二重らせんは加熱により変性し、その後一本鎖をさらに処理することができます。

他の点では同一の4つの調製物では、4つの塩基のそれぞれの1つがジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)として添加されます。 これらの鎖末端ddNTPには、次のヌクレオチドのリン酸基を結合するための3′-ヒドロキシ基がありません。 新しく合成された鎖へのそれらの付加は、OH基が欠落しているため、DNAポリメラーゼによるDNA伸長を停止します。

その結果、異なる長さのDNAフラグメントが生成され、個々のバッチで常に同じddNTPで終わります。

シーケンシング反応後、すべてのアプローチからの標識されたブレークオフ産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって縦方向に分離されます。

放射性ゲルの露光後、シーケンスを写真フィルム(X線フィルム)で読み取ることができます。 対応する相補配列は、使用される一本鎖DNAテンプレートの配列です。 今日では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のバリエーションがシーケンス反応として使用されています。

PCRとは異なり、プライマーは1つしか使用されないため、DNAは直線的にのみ増幅されます。

1980年代初頭、フリッツM.ポールと彼の研究グループはDNAシーケンシングのための放射性法を開発しました。 このシーケンシング技術では、DNA分子は電気泳動分離中にキャリアに転送されます。

「ダイレクトブロッティング電気泳動システムGATC1500」は、コンスタンツを拠点とする企業GATCBiotechによって販売されました。 DNAシーケンサーは、たとえば、酵母の2番染色体を配列決定するためのヨーロッパのゲノムプロジェクトで使用されました。 Saccharomyces cerevisiae

1990年代初頭以来、蛍光色素で標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸が特に使用されてきました。 4つのddNTPは、それぞれ異なる色素と結合しています。 この変更により、4つのddNTPすべてを1つの反応容器に追加することが可能になります。

別々のアプローチに分割して放射性同位元素を処理する必要はもうありません。 得られた連鎖停止生成物は、キャピラリー電気泳動によって分離され、レーザーによって蛍光を発するように励起されます。

したがって、各DNAフラグメントの最後にあるddNTPは、異なる色の蛍光を示します。 この蛍光は、検出器で検出できます。 エレクトロフェログラムは、配列決定されたDNA鎖の塩基配列を直接示しています。

サンガーシーケンシングの典型的なワークフロー。
サンガーシーケンシングの典型的なワークフロー。 画像ソース:Estevezj、ウィキメディアコモンズ

現代のアプローチ

研究および診断におけるDNA配列決定の重要性が増すにつれて、スループットの向上を可能にする方法が開発されてきました。 現在、約8日で完全なヒトゲノムの配列を決定することが可能です。 対応する方法は、第2世代シーケンスと呼ばれます。

さまざまな企業が、さまざまな長所と短所を持つ方法を開発しています。 ここにリストされているものとは別に、他のものがあります。 第2世代のDNAシーケンスは、ジャーナルNatureMethodsによって「2007年のメソッド」に選ばれました。

パイロシーケンスを使用したDNAシーケンス

パイロシーケンスでは、DNAポリメラーゼを使用して、DNAカウンター鎖を合成しますが、DNAポリメラーゼの種類はさまざまです。

DNA混合物をDNAアダプターとライゲーションし、相補的なアダプター配列を介してビーズに結合します。 DNAをロードしたビーズは、細孔のあるプレートに配置されます。 検出は光検出器に依存しています。

DNAポリメラーゼは、新しく合成されたDNA鎖に個々のヌクレオチドを連続的に結合するため、「動作中」に観察されます。 ヌクレオチドの挿入が成功すると、検出器によって検出される光信号に変換されます。 シーケンスされるDNAはマトリックス鎖として機能し、一本鎖の形で利用できます。

DNA鎖の伸長は、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の1つを補完的に加えることによって行われます。 適切なヌクレオチドが追加されると、シグナルが得られます。 不適切なNTPを追加しても、検出可能な信号は発生しません。 次に、既存のNTPが破棄され、別のタイプが追加されます。これは、反応が再び示されるまで続きます。

これはルシフェラーゼ酵素を介した反応です。 相補的なヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって組み込まれると、ピロリン酸(PPi)が放出されます。 ピロリン酸はATPスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸(ATP)に変換されます。

ATPは、ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換するルシフェラーゼ反応を促進します。 これにより、検出可能な光信号が生成されます。その強度は、消費されたATPに比例します。

パイロシーケンスは、特定の頻度を決定するために使用されています遺伝子突然変異、例えば遺伝病の調査。 パイロシーケンスは簡単に自動化でき、DNAサンプルの高度な並列分析に適しています。

パイロシーケンス。
パイロシーケンス。 画像ソース:Thisisjp、ウィキメディアコモンズ

ハイブリダイゼーションによる配列決定

この目的のために、短いDNAセクション(オリゴヌクレオチド)は、ガラスキャリア(DNAチップまたはマイクロアレイ)上で行と列に固定されます。

配列決定されるDNAの断片は色素で標識され、オリゴヌクレオチドマトリックスに適用されます。 これにより、相補的な固定および遊離DNAセクションが互いにハイブリダイズすることができます。 結合していないフラグメントを洗い流した後、ハイブリダイゼーションパターンをカラーラベルとその強度から読み取ります。

固定オリゴヌクレオチドの配列およびそれらの重複領域は既知である。 したがって、カラーパターンは、最終的には未知のDNAの基礎となる全体的なシーケンスを推測するために使用できます。

イオン半導体DNAシーケンシングシステム

ザ・イオントレントメソッドは、半導体チップ技術を使用して、集積回路を使用して直接非光学ゲノムシーケンスを実行します。

シーケンシングデータは、テンプレート依存のDNAポリメラーゼによって生成されたイオンの検出から直接取得されます。 この方法で使用される半導体チップは、イオン感応性電界効果トランジスタを備えています。 そのセンサーは、ポリメラーゼ反応が行われる120万ウェルのグリッドに配置されています。 このグリッドにより、独立したシーケンス反応を並行して同時に検出できます。

相補型金属酸化膜半導体(CMOS)技術が使用されており、高い測定点密度で費用効果の高い反応が可能です。

イオン半導体シーケンシング技術、出典:Konrad Foerstner、ウィキメディアコモンズ
イオン半導体シーケンシング技術、出典:Konrad Foerstner、ウィキメディアコモンズ

ブリッジ合成によるシーケンス

このシーケンス技術は、Solexa / Illuminaのブリッジ合成によるシーケンスとして知られています。 配列決定される二本鎖DNAは、両端が異なるアダプター配列で両端がライゲーションされています。

次に、DNAを変性させ、希釈後に一本鎖の形でキャリアプレートにライゲーションします。 そして、ブリッジ増幅によってその場でさらに増幅されます。 これにより、キャリアプレート上に増幅されたDNAの個々の領域(クラスター)が作成され、クラスター内で同じ配列になります。

PCR反応は、4つの異なる色の蛍光鎖終結基質を使用します。 サイクルごとに組み込まれるそれぞれの塩基は、クラスター内でリアルタイムに決定されます。

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オリゴライゲーション検出によるシーケンシング(固体)Applied Biosystemsは、Sequencing byLigationのバリエーションです。

DNAライブラリーは希釈され、DNAポリメラーゼでマイクロビーズに結合されます。 次に、DNAはエマルジョンPCRで増幅されます。 したがって、各マイクロビーズには、単一のDNA配列の複数のコピーが含まれています。 マイクロビーズは3 ‘末端が修飾されているため、キャリアプレートに個別に取り付けることができます。

プライマー結合後、4つの異なる切断可能なプローブが追加され、それぞれが異なる蛍光色でマークされます。 それらは最初の2つのヌクレオチド(CA、CT、GG、GC)によってDNAテンプレートに結合します。 次に、マイクロビーズをDNAリガーゼでライゲーションします。 次に、プローブが切断され、それによってラベルが解放されます。

最大5つのプライマーを使用して、DNA配列の各塩基が少なくとも2つの異なるライゲーション反応で決定されます。

SOLiDプラットフォーム。
SOLiDプラットフォーム、画像ソース:Philippe Hupe、ウィキメディアコモンズ

ペアエンドタグによるDNAシーケンシング

DNA配列の末端から短いDNA断片を生成することにより、明確に識別可能なシグナルを得ることができます。 このDNAシーケンシング法はペアエンドタグシーケンシング、PETSとしても知られています。

第3世代のDNAシーケンシング

初めて、第3世代のシーケンスでは、単一分子の実験として単一分子の反応を測定します。

これにより、シーケンシングの前にPCRで増幅する必要がなくなります。 ポリメラーゼは、いくつかのDNA配列に結合するためのバイアスを示します。 したがって、これは熱安定性DNAポリメラーゼによる不均一な増幅を回避します。

したがって、一部のシーケンスは見落とされる可能性があります。 さらに、個々の細胞のゲノムを調べることができます。

解放された信号はリアルタイムで記録されます。 第3世代のDNAシーケンスでは、使用する方法に応じて2つの異なる信号が記録されます。 それらは放出されたプロトンまたはフルオロフォアです。 個々の細胞のDNAおよびRNAシーケンスは、ジャーナルNatureMethodsによって「2013年のメソッド」に選ばれました。

第3世代のシーケンス技術。 画像ソース:Chandra Shekhar Pareek、Rafal Smoczynski、Andrej Tretyn、ウィキメディアコモンズ
第3世代のシーケンス技術。 画像ソース:Chandra Shekhar Pareek、Rafal Smoczynski、Andrej Tretyn、ウィキメディアコモンズ

ナノポアシーケンシング

ナノポアシーケンシング人工的に作成された膜に埋め込まれたナノポアを通るイオンの流れの変化に基づいています。 ナノポアは、生物学的または合成のポア、あるいは半合成のポアです。 ナノポアは、特に高い電気抵抗を持つ人工膜に埋め込まれています。

通常のイオンチャネルとは対照的に、細孔は恒久的に開いています。 これにより、電位を印加した後、膜を通るイオンの一定の流れが可能になります。 細孔を通過するDNA分子は、電流の減少につながります。 この電流減少には、各ヌクレオチドに固有の振幅があり、測定して対応するヌクレオチドに割り当てることができます。

一本鎖シーケンシングでは、二本鎖DNA鎖がヘリカーゼによって分離され、ナノポアに導入されます。

MspA細孔の場合、DNAの4つのヌクレオチドが同時に細孔内に配置されます。 通過速度は、とりわけ、膜全体のpH値の差に依存します。 4つのヌクレオチドのそれぞれの特定のイオン電流の変化により、配列を読み取ることができます。

評価は、たとえば、Poretoolsソフトウェアを使用して実行されます。 この方法の利点は、長いDNA鎖でも一定の精度があることです。 メソッドのバリエーションは、タンパク質のシーケンスに使用されます。

ナノポアシーケンシング技術は、英国の会社Oxford NanoporeTechnologiesによって進歩しています。 彼らの「MinION」シーケンサーは当初、「早期アクセスプログラム」を通じてのみ利用可能でした。 しかし、2015年から従来の流通チャネルを通じて利用可能になっています。

出発する前に、次世代シーケンシングベースをチェックしてください全ゲノムシーケンス