Sequenciamento completo do exoma – apenas as regiões codificadoras de proteínas são as melhores?

O que é o sequenciamento completo do exoma?

O sequenciamento completo do exoma (WES) é o sequenciamento do exoma, todos os genes codificadores de proteínas no genoma. O sequenciamento completo do exoma envolve duas etapas. A primeira etapa é direcionar as sequências apenas no exoma humano. Na genética humana, essas regiões-alvo são cerca de 60 milhões de pares de bases, ou cerca de 1% do genoma humano de referência. A segunda etapa é sequenciar o DNA usando qualquer plataforma de sequenciamento de DNA de alto rendimento e analisar os resultados.

O sequenciamento do exoma torna possível detectar mudanças genéticas que levam a mudanças nas sequências de proteínas, que por sua vez podem levar a doenças como aterosclerose , doença de Alzheimer , e outros. Muitas doenças ocorrem na região codificadora de proteínas do genoma e esse processo permite que os usuários aprendam mais sobre sua predisposição à doença do que a análise de um único gene. No entanto, agora se sabe que variações de DNA fora dos exons podem afetar a atividade do gene e a produção de proteínas e também levar a distúrbios genéticos. O sequenciamento completo do exoma não teria essas variações.

No passado, a principal vantagem do sequenciamento de exoma era a capacidade de realizar uma maior triagem de genes e detectar mutações associadas a doenças, como variantes do número de cópias, de uma forma que era econômica e consumia menos tempo do que o sequenciamento do genoma completo. No entanto, graças aos avanços na tecnologia de sequenciamento, o sequenciamento do genoma inteiro agora é tão rápido e acessível. Nebula Genomics oferece o sequenciamento completo do genoma 30X mais acessível por US $ 299 ou menos. Nós decodificamos 100% do seu DNA, não apenas 1% como com o sequenciamento completo do exoma, fornecendo a você a visão mais abrangente do seu DNA.

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Execução do sequenciamento completo do exoma

O sequenciamento completo do exoma começa com o isolamento e enriquecimento do DNA e termina com o sequenciamento e análise do DNA.

Estratégias de isolamento e enriquecimento de DNA

O DNA é isolado de uma amostra fornecida, como uma amostra de saliva ou esfregaço de bochecha. A forma mais comum de isolamento de DNA é a extração com fenol-clorofórmio.

Existem várias estratégias para enriquecer o DNA de amostras. O método usado geralmente depende da amostra e do resultado desejado.

Sequenciamento completo do exoma - etapa de hibridização de DNA
Hibridização de DNA usada para isolar a região do exoma do genoma. Wikipedia CC Attribution 3.0 Unported .
  • PCR: a reação em cadeia da polimerase (PCR) é a forma mais comum de amplificar os fragmentos de DNA desejados para sequenciamento.
  • Inversão molecular: Este método envolve o fechamento da região de interesse em um anel. Um primer de oligonucleotídeo de DNA de fita simples contém uma parte central com uma sequência universal com locais de restrição, enquanto as extremidades são complementares às duas seções de DNA genômico entre as quais a sequência de interesse está localizada.
  • Hibridização, captura baseada em array: microarranjos são usados que contêm oligonucleotídeos de fita simples anexados a um substrato com sequências do genoma capazes de cobrir os locais de interesse. O DNA genômico é cortado em fragmentos, as extremidades dos fragmentos são tornadas cegas e primers universais são adicionados. Após a hibridização dos fragmentos com sondas em microarrays, os fragmentos não hibridizados são lavados do substrato, e os fragmentos restantes são então amplificados usando PCR
  • Captura em solução: um conjunto de sondas é sintetizado em solução e fixado em esferas de estreptavidina. As contas são colocadas em uma solução com DNA genômico fragmentado, onde as sondas são hibridizadas seletivamente para os locais genômicos desejados, após o que as contas com os fragmentos de interesse são precipitadas e lavadas. As seções são então sequenciadas.

Sequenciamento de DNA

Existem muitos Sequenciamento de próxima geração (NGS) plataformas de tecnologia disponíveis. Alguns incluem o sequenciador Roche 454 e os sistemas Life Technologies SOLiD, o Life Technologies Ion Torrent e o Illumina Genome Analyzer II (extinto) e os instrumentos das séries Illumina MiSeq, HiSeq e NovaSeq subsequentes. ‘Leitura curta’ Os sistemas NGS são ideais para analisar muitos trechos relativamente curtos da sequência de DNA, como encontrados no exoma.

Sequenciamento de DNA de exoma completo
Após a amplificação, o DNA alvo é analisado por meio de sequenciamento de alto rendimento. Wikipedia CC Attribution 3.0 Unported .

Análise de dados

Mesmo o sequenciamento de apenas 1% do genoma humano gera muitos dados de sequenciamento de exoma e requer análise de dados pesada, para a qual existem vários programas para alinhar e montar leituras de sequência. Algumas estratégias usadas para melhorar a qualidade da geração de dados incluem:

  • Comparando as variantes genéticas identificadas entre sequenciamento e genotipagem baseada em array (se possível)
  • Comparando os SNPs de codificação a um indivíduo sequenciado do genoma inteiro com o transtorno
  • Comparando os SNPs de codificação com o sequenciamento Sanger de indivíduos HapMap

Para criar chamadas variantes , programas de análise identificam variantes de dados de sequência para criar vários arquivos. Alguns dos arquivos comuns são arquivos FASTQ, BAM / CRAM e VCF.

Resultados do sequenciamento completo do exoma
Os resultados do sequenciamento completo do exoma podem ser usados para diagnosticar doenças raras, identificar variantes do câncer ou rastrear doenças infecciosas. Wikipedia CC Atribuição 2.0 Genérico .

Você pode ler mais sobre todo o procedimento de sequenciamento do exoma em todo o sequenciamento do exoma página wiki .

Quem deve fazer o teste?

o Colégio Americano de Genética Médica e Genômica tem políticas sobre quando os métodos de sequenciamento devem ser usados, quais resultados podem surgir e o que os resultados podem indicar.

Especificamente, eles recomendam que o teste genético seja considerado para certos indivíduos, incluindo:

  1. Os dados de fenótipo ou história familiar implicam fortemente uma etiologia genética, mas o fenótipo não corresponde a um distúrbio específico para o qual um teste genético direcionado a um gene específico está disponível em uma base clínica
  2. Um paciente apresenta uma doença genética definida que demonstra um alto grau de heterogeneidade genética, tornando a análise de WES ou WGS de vários genes simultaneamente uma abordagem mais prática
  3. Um paciente apresenta uma provável doença genética, mas os testes genéticos específicos disponíveis para esse fenótipo não conseguiram chegar a um diagnóstico
  4. Um feto com uma provável doença genética em que testes genéticos específicos

Vantagens do sequenciamento completo do exoma

Tecnologia de sequenciamento de exoma inteiro, como outros Métodos de teste de DNA , tem como objetivo usar o genoma para ajudar a diagnosticar e orientar tratamentos para distúrbios mendelianos. Ele também fornece aos usuários informações que podem ajudá-los a alertar seus familiares sobre seus riscos.

Esse método tem várias vantagens sobre a análise de um único gene, um dos métodos mais comuns de sequenciamento de DNA. Em primeiro lugar, o sequenciamento completo do exoma fornece a capacidade de identificar uma ampla gama de mutações em genes candidatos que não são testados. Desta forma, um usuário pode identificar genes de doenças que podem não ter suspeitado de estarem sob risco. Em segundo lugar, na clínica, o sequenciamento completo do exoma fornece a capacidade de identificar casos em que mutações de diferentes genes contribuem para os diferentes fenótipos no mesmo paciente.

O sequenciamento completo do exoma também pode ser usado em pesquisas científicas para identificar doenças raras hereditárias não detectáveis por microarrays. Por exemplo, sabe-se que as variantes do alelo para vários distúrbios graves estão localizadas nos exões, mas também são extremamente raras na população. Assim, os ensaios de genotipagem padrão que precisam de grandes bancos de dados de alelos para serem eficazes muitas vezes perdem essas variantes. Vários estudos de caso destacam a utilidade de toda a abordagem de sequenciamento do exoma. Em 2009, um grupo de cientistas usaram o sequenciamento completo do exoma para identificar a mutação que causa a síndrome de Bartter e a diarréia congênita por cloreto.

Em 2011, a Ambry Genetics foi a primeira empresa oferecer um serviço de sequenciamento de exoma para diagnóstico clínico de doenças. A empresa afirma que os resultados do sequenciamento do exoma permitirão diagnosticar doenças para as quais as abordagens diagnósticas tradicionais não são aplicáveis. Você pode ler mais sobre a história e os resultados de Genética Ambry em nossa análise de produto!

Fluxo de trabalho de sequenciamento de exoma completo
Fluxo de trabalho de sequenciamento de exoma completo. Wikipedia CC Atribuição 2.0 Genérico .

Limitações do sequenciamento completo do exoma

Sequenciamento de exoma completo e sequenciamento de genoma completo : Ambos os procedimentos são tecnologias de sequenciamento de última geração. Embora o sequenciamento completo do exoma demonstre algumas vantagens sobre a genotipagem baseada em microarray para a análise clínica do risco de doença, ele também tem limitações. A diferença mais importante entre o exoma completo e o sequenciamento do genoma completo é a quantidade de DNA sequenciado. Como o sequenciamento completo do exoma decodifica apenas 1% do genoma, ele falha em analisar os outros 99%, incluindo regiões estruturais e não codificantes. Por outro lado, o Sequenciamento do Genoma Completo revela 100% do seu DNA que inclui todos os 3 bilhões de pares de bases (apenas 40 milhões de pares de bases são cobertos com o sequenciamento do exoma completo).

Quanto custa o sequenciamento do exoma inteiro? Por um tempo, o sequenciamento de todo o exoma foi considerado o tipo mais benéfico de sequenciamento de DNA, pois fornecia uma visão expandida das regiões de codificação do DNA em comparação com a genotipagem de microarray a um preço muito mais baixo do que o sequenciamento do genoma completo. De qualquer modo, já não é este o caso.

O sequenciamento do genoma completo pode ser obtido por uma fração do preço original e fornecer mais informações do que o sequenciamento do exoma completo. Em Nebula Genomics , você pode obter todo o seu genoma sequenciado por menos de US $ 299. Isso é comparável e até mais barato do que muitos produtos domésticos de sequenciamento de exoma completo.

Microarray cromossômico vs sequenciamento de exoma completo vs sequenciamento de genoma completo

Genotipagem de microarraySequenciamento completo do exomaSequenciamento do genoma completo
ObjetivoIdentifique variantes específicasDecodifique todos os genesDecodifique todos os genes, bem como todas as regiões estruturais e não codificantes
Taxa de transferênciaBaixo rendimentoAlto rendimentoAlto rendimento
Requer identificação prévia da variantesimNãoNão
Quantidade de cobertura0,5 milhão de posições
(0,02% do genoma)
60 milhões de posições
(~ 1% do genoma)
6 bilhões de posições
(~ 100% do genoma)
Custo~ $ 100~ $ 300~ $ 1000
(mas a Nebula Genomics oferece por US $ 299)

Direto para empresas de sequenciamento de exoma completo do consumidor

Várias empresas vendem produtos de sequenciamento de exoma inteiros. Alguns desses produtos devem ser solicitados por meio de um provedor de saúde e podem estar cobertos por um seguro. Esses testes são freqüentemente usados para diagnosticar doenças. Algumas empresas oferecem o serviço como testes domiciliares diretos ao consumidor que são analisados em laboratórios aprovados pela CLIA e credenciados pelo CAP, de forma que, embora não possam ser utilizados como ferramentas de diagnóstico, podem ser levados aos profissionais de saúde para consulta.

23andMe executou um programa piloto de sequenciamento de exoma completo que foi anunciado em setembro de 2011 e foi descontinuado em 2012. Os consumidores podem obter dados de exoma a um custo de US $ 999. A empresa forneceu dados brutos e não ofereceu análises.

  • Genética Ambry foi a primeira empresa a oferecer um serviço de sequenciamento de exoma para diagnóstico clínico de doenças. Hoje, os clientes podem solicitar exames por meio de provedores de saúde e a maior parte do custo é coberta pelo seguro.
  • CircleDNA oferece em casa o WES por $ 189 – $ 629 e muitos testes incluem aconselhamento genético. Esta empresa também colabora com DNAFit .
  • Dante Labs ‘ O WES custa $ 849, a um preço muito mais alto do que os concorrentes. Essa empresa também oferece sequenciamento de genoma completo a partir de US $ 599.
  • Genomas completos oferece o WES a partir de $ 525.
  • GeneDx começou a oferecer o WES em 2012. Seus preços são variáveis.
  • HelixDNA oferece o WES por um preço razoável de $ 145 mais $ 299 adicionais por um aplicativo útil.
  • Ambos Invitae WES e Myriad Genetics oferecer testes de diagnóstico. Esses testes, embora caros, podem ser cobertos pelo seguro.
  • Tellmegen examina regiões selecionadas do exoma por estarem ligadas a doenças e saúde. Os testes custam $ 235.

Você pode ler muito mais críticas da empresa em nosso blog e confira nosso guia completo para o melhor kit de teste de DNA e outros testes caseiros .