Secuenciación completa del exoma: ¿solo las regiones codificantes de proteínas son las mejores?

¿Qué es la secuenciación del exoma completo?

La secuenciación del exoma completo (WES) es la secuenciación del exoma, todos los genes que codifican proteínas en el genoma. La secuenciación del exoma completo implica dos pasos. El primer paso es apuntar a secuencias en el exoma humano únicamente. En genética humana, estas regiones objetivo son aproximadamente 60 millones de pares de bases, o aproximadamente el 1% del genoma de referencia humano. El segundo paso es secuenciar el ADN utilizando cualquier plataforma de secuenciación de ADN de alto rendimiento y analizar los resultados.

La secuenciación del exoma permite detectar cambios genéticos que conducen a cambios en las secuencias de proteínas, que a su vez pueden conducir a enfermedades como aterosclerosis , Enfermedad de Alzheimer , y otros. Muchas enfermedades ocurren en la región codificadora de proteínas del genoma y este proceso permite a los usuarios aprender más sobre su predisposición a la enfermedad que el análisis de un solo gen. Sin embargo, ahora se sabe que las variaciones del ADN fuera de los exones pueden afectar la actividad genética y la producción de proteínas y también conducir a trastornos genéticos. La secuenciación del exoma completo pasaría por alto estas variaciones.

En el pasado, la principal ventaja de la secuenciación del exoma era la capacidad de realizar un mayor cribado de genes y detectar mutaciones asociadas a la enfermedad, como las variantes del número de copias, de una manera que era rentable y consumía menos tiempo que la secuenciación del genoma completo. Sin embargo, gracias a los avances en la tecnología de secuenciación, la secuenciación del genoma completo es ahora igual de rápida y asequible. Genómica de la nebulosa ofrece la secuenciación del genoma completo 30 veces más asequible a $ 299 o menos. Decodificamos el 100% de su ADN, no solo el 1% como ocurre con la secuenciación completa del exoma, brindándole la vista más completa de su ADN.

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Realización de la secuenciación del exoma completo

La secuenciación del exoma completo comienza con el aislamiento y el enriquecimiento del ADN y finaliza con la secuenciación y el análisis del ADN.

Estrategias de enriquecimiento y aislamiento de ADN

El ADN se aísla de una muestra proporcionada, como una muestra de saliva o un hisopo bucal. La forma más común de aislamiento de ADN es la extracción con fenol-cloroformo.

Existen varias estrategias para enriquecer el ADN de las muestras. El método utilizado a menudo depende de la muestra y del resultado deseado.

Secuenciación del exoma completo: paso de hibridación de ADN
Hibridación de ADN utilizada para aislar la región del exoma del genoma. Wikipedia CC Atribución 3.0 No exportado .
  • PCR: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la forma más común de amplificar los fragmentos de ADN deseados para la secuenciación.
  • Inversión molecular: este método implica cerrar la región de interés en un anillo. Un cebador oligonucleotídico de ADN monocatenario contiene una parte central con una secuencia universal con sitios de restricción, mientras que los extremos son complementarios a las dos secciones de ADN genómico entre las que se ubica la secuencia de interés.
  • Hibridación, captura basada en matrices: se utilizan microarrays que contienen oligonucleótidos monocatenarios unidos a un sustrato con secuencias del genoma capaces de cubrir los sitios de interés. El ADN genómico se corta en fragmentos, los extremos de los fragmentos se rompen y se agregan cebadores universales. Después de la hibridación de los fragmentos con sondas en microarrays, los fragmentos no hibridados se lavan del sustrato y los fragmentos restantes se amplifican mediante PCR.
  • Captura en solución: se sintetiza un conjunto de sondas en solución y se fija en perlas de estreptavidina. Las perlas se colocan en una solución con ADN genómico fragmentado, donde las sondas se hibridan selectivamente con los sitios genómicos deseados, después de lo cual las perlas con los fragmentos de interés se precipitan y lavan. A continuación, se ordenan las secciones.

Secuencia ADN

Hay muchos Secuenciación de próxima generación (NGS) plataformas tecnológicas disponibles. Algunos incluyen el secuenciador Roche 454 y los sistemas Life Technologies SOLiD, Life Technologies Ion Torrent y Illumina Genome Analyzer II (desaparecido) y los instrumentos posteriores de las series Illumina MiSeq, HiSeq y NovaSeq. ‘Lectura corta’ Los sistemas NGS son ideales para analizar muchos tramos relativamente cortos de secuencia de ADN, como se encuentra en el exoma.

Secuenciación del ADN del exoma completo
Después de la amplificación, el ADN diana se analiza mediante secuenciación de alto rendimiento. Wikipedia CC Atribución 3.0 No exportado .

Análisis de los datos

Incluso la secuenciación de solo el 1% del genoma humano genera una gran cantidad de datos de secuenciación del exoma y requiere un análisis de datos pesado, para lo cual existen numerosos programas para alinear y ensamblar lecturas de secuencia. Algunas estrategias que se utilizan para mejorar la calidad de la generación de datos incluyen:

  • Comparar las variantes genéticas identificadas entre secuenciación y genotipado basado en matrices (si es posible)
  • Comparación de los SNP codificadores con un individuo secuenciado del genoma completo con el trastorno
  • Comparación de los SNP codificadores con la secuenciación de Sanger de individuos HapMap

Crear llamadas variantes , los programas de análisis identifican variantes a partir de datos de secuencia para crear varios archivos. Algunos de los archivos comunes son archivos FASTQ, BAM / CRAM y VCF.

Resultados de la secuenciación del exoma completo
Los resultados de la secuenciación del exoma completo se pueden usar para diagnosticar enfermedades raras, identificar variantes de cáncer o rastrear enfermedades infecciosas. Wikipedia CC Atribución 2.0 Genérico .

Puede leer más sobre todo el procedimiento de secuenciación del exoma sobre la secuenciación completa del exoma. página wiki .

¿Quién debería hacerse la prueba?

los Colegio Americano de Genética y Genómica Médica tiene políticas sobre cuándo deben usarse los métodos de secuenciación, qué resultados pueden surgir y qué pueden indicar los resultados.

Específicamente, recomiendan que se consideren las pruebas genéticas para ciertas personas, que incluyen:

  1. Los datos del fenotipo o antecedentes familiares implican fuertemente una etiología genética, pero el fenotipo no se corresponde con un trastorno específico para el que se dispone de una prueba genética dirigida a un gen específico sobre una base clínica.
  2. Un paciente presenta un trastorno genético definido que demuestra un alto grado de heterogeneidad genética, lo que hace que el análisis WES o WGS de múltiples genes simultáneamente sea un enfoque más práctico
  3. Un paciente presenta un posible trastorno genético, pero las pruebas genéticas específicas disponibles para ese fenotipo no han logrado llegar a un diagnóstico.
  4. Un feto con un posible trastorno genético en el que se realizan pruebas genéticas específicas.

Ventajas de la secuenciación del exoma completo

Tecnología de secuenciación del exoma completo, como otras Métodos de prueba de ADN , tiene como objetivo utilizar el genoma para ayudar a diagnosticar y orientar los tratamientos para los trastornos mendelianos. También proporciona a los usuarios información que puede ayudarles a advertir a sus familiares sobre su riesgo.

Este método tiene varias ventajas sobre el análisis de un solo gen, uno de los métodos más comunes de secuenciación de ADN. Primero, la secuenciación del exoma completo proporciona la capacidad de identificar una amplia gama de mutaciones en genes candidatos que no se prueban. De esta manera, un usuario puede identificar genes de enfermedades que posiblemente no sospechaba que estaban en riesgo. En segundo lugar, en la clínica, la secuenciación del exoma completo proporciona la capacidad de identificar casos en los que mutaciones de diferentes genes contribuyen a los diferentes fenotipos en el mismo paciente.

La secuenciación del exoma completo también se puede utilizar en la investigación científica para identificar enfermedades raras heredadas no detectables por microarrays. Por ejemplo, se sabe que las variantes alélicas de varios trastornos graves se localizan en los exones, pero también son extremadamente raras en la población. Por lo tanto, los ensayos de genotipado estándar que necesitan grandes bases de datos de alelos para ser eficaces a menudo pasan por alto estas variantes. Múltiples estudios de casos destacan la utilidad del enfoque de secuenciación del exoma completo. En 2009, un grupo de científicos utilizó la secuenciación del exoma completo para identificar la mutación que causa el síndrome de Bartter y la diarrea congénita por cloruro.

En 2011, Ambry Genetics fue el primera empresa ofrecer un servicio de secuenciación de exomas para el diagnóstico clínico de enfermedades. La compañía afirma que los resultados de la secuenciación del exoma les permitirán diagnosticar enfermedades para las que los enfoques de diagnóstico tradicionales no son aplicables. Puede leer más sobre el historial y los resultados de Genética Ambry en nuestra revisión de producto!

Flujo de trabajo de secuenciación del exoma completo
Flujo de trabajo de secuenciación del exoma completo. Wikipedia CC Atribución 2.0 Genérico .

Limitaciones de la secuenciación del exoma completo

Secuenciación del exoma completo y secuenciación del genoma completo : Ambos procedimientos son tecnologías de secuenciación de próxima generación. Si bien la secuenciación del exoma completo demuestra algunas ventajas sobre el genotipado basado en microarrays para el análisis clínico del riesgo de enfermedad, también tiene limitaciones. La diferencia más importante entre la secuenciación del exoma completo y del genoma completo es la cantidad de ADN secuenciado. Dado que la secuenciación del exoma completo decodifica solo el 1% del genoma, no analiza el otro 99%, incluidas las regiones estructurales y no codificantes. Por otro lado, Whole Genome Sequencing revela el 100% completo de su ADN que incluye los 3 mil millones de pares de bases (solo 40 millones de pares de bases están cubiertos con la secuenciación completa del exoma).

¿Cuánto cuesta la secuenciación del exoma completo? Durante un tiempo, la secuenciación del exoma completo se consideró el tipo más beneficioso de secuenciación de ADN, ya que proporcionaba una vista ampliada de las regiones codificantes de ADN en comparación con el genotipado de microarrays a un precio mucho menor que la secuenciación del genoma completo. Sin embargo, esto ya no es el caso.

La secuenciación del genoma completo se puede lograr por una fracción de su precio original y proporcionar más información que la secuenciación del exoma completo. A Genómica de la nebulosa , puede secuenciar todo su genoma por menos de $ 299. Esto es comparable e incluso más barato que muchos productos de secuenciación de exomas completos para el hogar.

Microarreglo cromosómico frente a secuenciación del exoma completo frente a secuenciación del genoma completo

Genotipado de microarraysSecuenciación del exoma completoSecuenciación del genoma completo
PropósitoIdentificar variantes específicasDecodificar todos los genesDecodificar todos los genes, así como todas las regiones estructurales y no codificantes.
RendimientoBajo rendimientoAlto rendimientoAlto rendimiento
Requiere identificación previa de variantesiNoNo
Cantidad de cobertura0,5 millones de posiciones
(0,02% del genoma)
60 millones de puestos
(~ 1% del genoma)
6 mil millones de posiciones
(~ 100% del genoma)
Costo~ $ 100~ $ 300~ $ 1000
(pero Nebula Genomics lo ofrece por $ 299)

Directo a las empresas de secuenciación del exoma completo del consumidor

Varias empresas venden productos completos de secuenciación del exoma. Algunos de estos productos deben solicitarse a través de un proveedor de atención médica y pueden estar cubiertos por un seguro. Estas pruebas se utilizan a menudo para diagnosticar enfermedades. Algunas empresas ofrecen el servicio como pruebas domiciliarias directas al consumidor que se analizan en laboratorios aprobados por CLIA y acreditados por CAP, por lo que, si bien no se pueden usar como herramientas de diagnóstico, se pueden llevar a los proveedores de atención médica para su consulta.

23andMe ejecutó un programa piloto de secuenciación completa del exoma que se anunció en septiembre de 2011 y se suspendió en 2012. Los consumidores podrían obtener datos del exoma a un costo de $ 999. La empresa proporcionó datos sin procesar y no ofreció análisis.

  • Genética ambry fue la primera empresa en ofrecer un servicio de secuenciación de exomas para el diagnóstico clínico de enfermedades. Hoy en día, los clientes pueden solicitar pruebas a través de proveedores de atención médica y la mayor parte del costo está cubierto por el seguro.
  • CircleDNA ofrece WES en casa por $ 189 – $ 629 y muchas pruebas incluyen asesoramiento genético. Esta empresa también colabora con DNAFit .
  • Dante Labs ‘ WES comienza en $ 849, a un precio mucho más alto que los competidores. Esta compañía también ofrece secuenciación del genoma completo a partir de $ 599.
  • Genomas completos ofrece WES desde $ 525.
  • GeneDx comenzó a ofrecer WES en 2012. Sus precios son variables.
  • HelixDNA ofrece WES a un precio razonable de $ 145 más $ 299 adicionales por una aplicación útil.
  • Ambos Invitae WES y Genética miríada ofrecemos pruebas de diagnóstico. Estas pruebas, aunque caras, pueden estar cubiertas por el seguro.
  • Tellmegen examina regiones seleccionadas del exoma que se sabe que están relacionadas con la enfermedad y la salud. Las pruebas cuestan $ 235.

Puedes leer muchos más reseñas de la empresa en nuestro blog y echa un vistazo a nuestro guía completa del mejor kit de prueba de ADN y otras pruebas caseras .